中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶抑制劑Sivelestat在非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌的作用機(jī)制

羅燕 莊振杰 沈璐 顧佳萍 王麗燕 徐佳麗

非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）是脂肪在肝臟中過度蓄積且與炎癥相關(guān)的進(jìn)展性肝臟疾病，是肝細(xì)胞癌發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素。脂質(zhì)積累驅(qū)動(dòng)先天免疫細(xì)胞激活和炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制是NASH 發(fā)生和發(fā)展的主要原因［1］，臨床上尚無有效的治療藥物。非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)肝細(xì)胞癌（nonalcoholic steatohepatitis related hepatocellular carcinoma，NASH-HCC）病程隱匿，可不伴纖維化直接發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)，脂多糖誘導(dǎo)肝臟中性粒細(xì)胞募集浸潤可以促進(jìn)肝細(xì)胞癌的形成［2］。中性粒細(xì)胞胞外陷阱可促進(jìn)NASH炎癥進(jìn)展及肝細(xì)胞癌的發(fā)展［3］，且與預(yù)后不良密切相關(guān)［4］。中性粒細(xì)胞受到各種致病因子刺激后，可釋放彈性蛋白酶（neutrophil elastase，NE），促進(jìn)NASH 的發(fā)生發(fā)展，NE 抑制劑Sivelestat 能夠顯著降低NASH 小鼠肝臟的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶水平及炎癥程度［5］。敲除NE可以改善西方飲食誘導(dǎo)的小鼠肝臟脂肪變及炎癥［6］。通過高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)聯(lián)合皮下注射鏈脲佐菌素的方法構(gòu)建C57BL/6J 小鼠NASH-HCC 模型，探討NE 抑制劑Sivelestat 在NASH-HCC 中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 實(shí)驗(yàn)小鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。高脂高膽固醇飼料（貨號(hào)：D12079B，Research Diet，美國）購自購自上海益同生物科技有限公司，配方包括21%脂肪（41 kcal%）、50%碳水化合物（43 kcal%）、20%蛋白質(zhì)（17 kcal%）和0.21%膽固醇。普通飼料購于江蘇協(xié)同生物技術(shù)有限公司。

鏈脲佐菌素（貨號(hào)：S0130，sigma，美國），Sivelestat（ 貨號(hào)：RAM0131，Ramidus AB，Sweden）；TRIZOL（ 貨號(hào)：15596018，Invitrogen， 美國）；Transcriptor First Strand Cdna Synthesis Kit（貨號(hào)：04897030001），F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master（ROX）（貨號(hào)：04913914001），Roche，德國；引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 動(dòng)物分組及造模 C57BL/6J 小鼠出生后4 天，皮下注射鏈脲佐菌素200 μg/只。斷乳后，取雄性小鼠，稱重、分組、編號(hào)。設(shè)置高脂高膽固醇飲食（STZ+HFHC）組、普通飲食（STZ+CD）組、Sivelestat干預(yù)（STZ+HFHC+Sivelestat）組。Sivelestat 干預(yù)，從HFHC 飲食2 周后開始，即第7 周齡，腹腔注射Sivelestat劑量為150 mg/kg，每周3 次，設(shè)置第12 周為觀察點(diǎn)，于第16 周干預(yù)結(jié)束。觀察Sivelestat 對(duì)NASH-HCC 的干預(yù)效果。

1.3 小鼠血清學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 禁食12 h，眼眶采血，收集血液標(biāo)本，以3000 r/min 離心15 min 分離血清。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)空腹血糖（FPG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、 高密度脂蛋白膽固醇（HDL）、 低密度脂蛋白膽固醇（LDL）等血生化指標(biāo)。

1.4 HE 染色 肝組織固定24～48 h 取出，流水沖洗5～10 min。梯度酒精脫水，75%酒精脫水1 次，1 h/次；95%酒精脫水2 次，1 h/次；無水乙醇脫水2 次，25 min/次。二甲苯透明2 次，10 min/次。65 ℃浸蠟2 次，1 h/次。石蠟包埋，切片。將石蠟切片放入二甲苯中，脫蠟10 min 后，依次浸入100%、95%、90%、80%、70%的酒精中各5 min，后置于蒸餾水中5 min。蘇木精液染色20 min，流水洗去蘇木精液，1%鹽酸乙醇分化3 s，返藍(lán)20 min，伊紅液染色2 min，稍水洗，再用梯度乙醇脫水，二甲苯透明，最后中性樹膠封片。觀察評(píng)價(jià)肝臟脂肪變、炎癥等病變情況，并作為NAFLD 活動(dòng)度積分（NAFLD activity scores，NAS）評(píng)分的依據(jù)。

1.5 熒光定量PCR 檢測(cè)脂質(zhì)合成基因的表達(dá) Trizol法提取RNA，取2μgRNA 模板，按照羅氏逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。使用SYBR 試劑盒，以20 μL 反應(yīng)體系進(jìn)行RCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為：取SYBR mix 10 μL，上下游引物各取0.8 μL，cDNA 模板2 μL，滅菌水補(bǔ)足20 μL 總體積。引物的終濃度為400 nM。以GAPDH 作為內(nèi)參基因，利用2-△△CT 法，計(jì)算mRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。引物序列，見表1。

表1 熒光定量PCR引物序列

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用ANOVA 單因素方差分析和Newman-Keuls。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Sivelestat 對(duì)NASH-HCC 小鼠肝重、肝指數(shù)及血生化指標(biāo)的影響 與12 周STZ+CD 對(duì)照組比較，模型組小鼠的ALT、AST、LDL、HDL、TC、肝重及肝指數(shù)水平明顯升高；Sivelestat 干預(yù)組小鼠的肝重、肝指數(shù)、HDL 水平較模型組顯著下降（P＜0.001）；Sivelestat 可以明顯降低NASH-HCC 小鼠的FPG、TC 水平（P＜0.01、P＜0.05）。見表2。與16 周對(duì)照組比較，模型組小鼠的肝重、肝指數(shù)、ALT、AST、HDL、LDL、TC 水平明顯升高（P＜0.05、P＜0.01 或P＜0.001；Silvestat 干預(yù)組小鼠的肝重、肝指數(shù)、ALT、FPG、TC、HDL、LDL 較模型組明顯降低（P＜0.05 或P＜0.001）。見表3。

表2 Silvestat干預(yù)至12周對(duì)NASH-HCC小鼠肝重、肝指數(shù)及血生化指標(biāo)的影響（±s）

表2 Silvestat干預(yù)至12周對(duì)NASH-HCC小鼠肝重、肝指數(shù)及血生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01，###P＜0.001

項(xiàng)目模型組干預(yù)組對(duì)照組肝重（g）1.65±0.41***1.06±0.19###0.92±0.17肝指數(shù)（%）0.08±0.03***0.05±0.01###0.05±0.01 ALT（U/L）185.18±172.24*79.6±38.2260.89±13.56 AST（U/L）350.91±214.79*232±63.75185.33±49.66 FPG（mmol/L）26.42±8.819.05±3.88**##18.23±7.49 HDL（mmol/L）4.6±1.84***1.92±0.61###2.25±0.51 LDL（mmol/L）3.68±3.37**1.22±0.580.62±0.19 TC（mmol/L）9.16±4.93***4.48±1.57#3.14±0.58 TG（mmol/L）1.34±0.811.19±0.341.1±0.33

表3 Silvestat干預(yù)至16周對(duì)NASH-HCC小鼠肝重、肝指數(shù)及血生化指標(biāo)的影響（±s）

表3 Silvestat干預(yù)至16周對(duì)NASH-HCC小鼠肝重、肝指數(shù)及血生化指標(biāo)的影響（±s）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001；與模型組比較，#P＜0.05，###P＜0.001

項(xiàng)目模型組干預(yù)組對(duì)照組肝重（g）2.19±0.79*1.39±0.24#1.07±0.16肝指數(shù)（%）0.11±0.04*0.05±0.02#0.06±0.16 ALT（U/L）202.6±101.44***127.22±52.04#85±54.44 AST（U/L）422±225.99**281.89±109.11201.8±86.19 FPG（mmol/L）29.99±6.178.35±6.31**###22.85±12.86 HDL（mmol/L）4.96±0.84***2.18±0.15###2.38±0.42 LDL（mmol/L）4.29±2.12***1.22±0.43###0.73±0.14 TC（mmol/L）10.42±3.12***5.46±1.26*###3.43±0.52 TG（mmol/L）1.37±0.341.12±0.421.45±0.57

2.2 Sivelestat 對(duì)NASH-HCC 小鼠肝臟病理的改變情況 肉眼可見模型組小鼠12 周、16 周肝臟腫大，顏色呈奶黃色。16 周模型小鼠肝臟表面可見多發(fā)或單發(fā)結(jié)節(jié)和許多白色點(diǎn)狀沉積物，發(fā)生率為100%。Sivelestat干預(yù)組12 周、16 周肝臟呈暗紅色，肝臟較模型組略小。干預(yù)組16 周肝臟可見白色沉積物，結(jié)節(jié)發(fā)生率為70%。從肝臟顏色、質(zhì)地等外觀來看，Sivelestat 可以改善肝臟外觀，降低肝臟結(jié)節(jié)的發(fā)生率。HE 染色顯示，Sivelestat 干預(yù)組12 周、16 周與同周齡模型組小鼠比較，脂肪變明顯減輕，見圖1A。從NAS 積分水平來看，12周和16 周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，模型組脂肪變、小葉內(nèi)炎癥及氣球樣變均顯著高于對(duì)照組。Sivelestat 干預(yù)至12 周可減輕脂肪變和小葉內(nèi)炎癥，總NAS 積分較模型組降低，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Sivelestat 干預(yù)至16 周，脂肪變水平有所減輕，炎癥水平略有升高，總NAS 積分與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1B-1I。

圖1 肝臟外觀、HE染色及NAS評(píng)分

2.3 脂質(zhì)合成相關(guān)基因FASN、SCD1、SREBP1c 的表達(dá)變化 造模16 周，模型組小鼠肝臟脂肪酸合成酶（FASN）、硬脂酰輔酶A 去飽和酶（SCD1）、甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白1c（SREBP1c）的表達(dá)均顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），Sivelestat 干預(yù)可減輕脂質(zhì)合成相關(guān)基因FASN、SCD1、SREBP1c 的表達(dá)（P＜0.05 或P＜0.01），見圖2。

圖2 肝臟脂質(zhì)合成相關(guān)基因表達(dá)比較

3 討論

慢性炎癥與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，長(zhǎng)期的慢性肝臟炎癥可進(jìn)一步引起肝纖維化、肝硬化、肝衰竭甚至發(fā)生肝細(xì)胞癌［7］。NASH 的發(fā)病機(jī)制主要是脂類在肝臟細(xì)胞的過度蓄積以及氧化應(yīng)激，進(jìn)一步導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥、壞死和纖維化［8］。氧化應(yīng)激引起脂質(zhì)過氧化、免疫細(xì)胞應(yīng)答、促炎信號(hào)分子激活觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)是NASH 進(jìn)展為肝細(xì)胞癌的重要機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn)，西方飲食誘導(dǎo)的NASH 模型中NE 可以調(diào)節(jié)神經(jīng)酰胺的從頭合成促進(jìn)NASH 進(jìn)展［6］，敲除NE 可以減輕NASH 小鼠肝臟炎癥以及Kupffer 細(xì)胞活化［9］。高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的APOE-/-小鼠NASH 模型小鼠肝內(nèi)NE 水平明顯升高，而NE 抑制劑Sivelestat 能夠顯著降低NASH 小鼠肝臟的炎癥程度，與CXCR4/CXCL12 信號(hào)通路有關(guān)［5］。筆者通過高脂高膽固醇飲食聯(lián)合皮下注射鏈脲佐菌素構(gòu)建C57BL/6J 小鼠NASH-HCC 模型，探討Sivelestat 在NASH-HCC 中的作用機(jī)制。

BIJNEN 等［10］研究發(fā)現(xiàn)，肥胖小鼠的脂肪組織巨噬細(xì)胞可以募集中性粒細(xì)胞，從而誘導(dǎo)肝巨噬細(xì)胞積累，促進(jìn)NASH 的發(fā)展。NE 可作用于TLR4 受體，活化Kupffer 細(xì)胞促進(jìn)肝臟炎癥的發(fā)生發(fā)展［11］。肝臟內(nèi)的巨噬細(xì)胞在長(zhǎng)期慢性炎癥浸潤刺激下可以促進(jìn)HCC 的發(fā)生和發(fā)展。NE 抑制劑Sivelestat 干預(yù)至16 周實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠的肝重、肝指數(shù)、ALT、AST、HDL、LDL、TC 水平明顯升高。干預(yù)組小鼠的肝重、肝指數(shù)、ALT、FPG、TC、HDL、LDL 較模型組明顯降低。Sivelestat 對(duì)模型小鼠肝酶ALT、AST 也有減輕作用，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。病理分析發(fā)現(xiàn)，Sivelestat可減輕小鼠肝臟脂肪變，減輕早期炎癥，降低肝臟表面結(jié)節(jié)的發(fā)生率。VAN DER WINDT 等［3］研究發(fā)現(xiàn)，游離脂肪酸可以促進(jìn)中性粒細(xì)胞細(xì)胞外陷阱NETs 的形成，利用DNAase 干預(yù)和PAD4-/-小鼠兩種方法抑制NETs形成，可以減輕肝臟炎癥，降低NASH-HCC 的發(fā)生，通過GFP 標(biāo)記骨髓細(xì)胞發(fā)現(xiàn)NASH-HCC 小鼠在12 周前表現(xiàn)出中性粒細(xì)胞浸潤、NETs 形成，而在12 周后主要為巨噬細(xì)胞浸潤，與本研究結(jié)論一致，Sivelestat 對(duì)NASH-HCC 早期炎癥有減輕作用。

高脂飲食喂養(yǎng)的肥胖小鼠脂肪組織中存在中性粒細(xì)胞浸潤和NE 沉積，敲除NE 可減輕肥胖小鼠胰島素抵抗和肝臟炎癥。NE 和其內(nèi)源性抑制劑A1AT 的失衡通過調(diào)節(jié)AMPK 通路影響能量消耗，促進(jìn)肥胖相關(guān)炎癥、脂肪組織重塑、胰島素抵抗和肝臟脂肪變性的發(fā)生［12］。脂質(zhì)生成的異常激活與代謝失調(diào)是腫瘤發(fā)生的新標(biāo)志。FASN 是脂肪酸合成酶，在多種腫瘤組織中可發(fā)現(xiàn)FASN表達(dá)升高。SCD1是合成單不飽和脂肪酸的限速酶，其參與的脂質(zhì)合成通路與肝細(xì)胞癌患者的進(jìn)展和臨床結(jié)局顯著相關(guān)［13］。SREBP1c 可以轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)FASN、SCD1 等多個(gè)脂質(zhì)合成相關(guān)基因，從而促進(jìn)肝臟的脂質(zhì)積累。FASN、SCD1、SREBP1c 的表達(dá)上調(diào)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。在本實(shí)驗(yàn)NASH-HCC 模型小鼠肝臟中亦檢測(cè)到FASN、SCD1、SREBP1c 表達(dá)明顯上調(diào)。

綜上所述，Sivelestat 可以減輕NASH-HCC 小鼠早期肝臟炎癥、減輕脂肪變，下調(diào)脂質(zhì)合成相關(guān)基因的表達(dá)，對(duì)NASH-HCC 的發(fā)生發(fā)展有一定的干預(yù)作用。