基于網絡藥理學分析當歸-白芍藥對治療腰椎間盤退變的潛在靶點及機制

徐彬 丁偉國 盛紅楓 徐衛星*

腰腿疼痛是成年人最常見的不適癥狀［1］，而椎間盤退變（intervertebral disc degeneration，IDD）是導致腰腿疼痛的最常見原因之一［2］。年齡、基因、營養、代謝、感染、生物力學等諸多因素都與IDD 發病相關，但確切的發病機制尚不明確。目前，主要的治療手段有保守治療、介入治療、手術治療，既不能延緩椎間盤的退變進程，也不能對退變椎間盤進行再生修復。IDD 可歸屬中醫“腰腿痛”范疇，認為其由肝腎虧虛、血瘀氣弱引起［3］，治以補肝益腎、活血通經為主，當歸、白芍是常用藥物，此藥對源自《仙授理傷續斷秘方》治療外傷瘀血作痛之主方四物湯，也常常出現在獨活寄生湯等治療骨傷疾病的經方中。研究表明，中藥治療腰椎間盤退變是通過多種功效的不同活性成分作用于多個環節或信號通路及靶點而產生治療效果。當歸-白芍藥對治療腰椎間盤退變仍處于初級階段，作用機制中涉及的活性成分、治療靶點及信號通路仍不完全清楚。本研究基于網絡藥理學理論系統、科學的探究當歸-白芍藥對治療腰椎間盤退變的作用靶點及機制。

1 研究方法

1.1 當歸-白芍的活性成分及作用靶點篩選 在中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數據庫中分別以“當歸”“白芍”為檢索詞，檢索其活性成分，設定口服生物利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18 進行篩選。使用Pubchem數據庫獲得上述成分的SDF 結構，導入Swiss Target Prediction 數據庫，取預測得分大于0 的靶標作為藥物靶點。

1.2 疾病相關靶點的篩選 使用OMIM、Disgenet、Genecards 數 據 庫 以“intervertebral disc degeneration”“lumbar intervertebral disc degeneration”為關鍵詞進行檢索，獲得疾病相關靶點。

1.3 當歸-白芍治療治療腰椎間盤退變關鍵靶點篩選 在Venny2.1 在線軟件作圖工具平臺上輸入篩選出的當歸-白芍藥對作用靶點及腰椎間盤退變關鍵靶點，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點。1.4 中藥-成分-靶點-疾病網絡構建及分析 將篩選出的關鍵靶點和藥物活性成分信息編輯成“藥物-成分”“成分-靶點”“疾病-靶點”關系文件和屬性文件，使用Cytoscape 3.7.2 軟件，構建“藥物-成分-靶點-疾病” 網絡圖。節點為當歸、白芍、藥物活性成分、關鍵靶點及腰椎間盤退變，邊為當歸、白芍與對應活性成分、活性成分與靶點、腰椎間盤退變與靶點的相互作用關系。

1.5 PPI 網絡構建及核心靶點分析 將上述藥物-疾病共同靶點輸入至STRING 數據庫中進行檢索，設置蛋白種類為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，構建蛋白相互作用的PPI 網絡圖。

1.6 核心靶點篩選 將PPI 網絡導入Cystoscap 3.7.2中，通過Network Analyzer 工具進行拓撲分析，以degree，betweenness centrality，average shortest path length 和closeness centrality 四個參數為參考標準，通過degree 排序，選取分值大于平均分的基因作為核心靶點，將前30 個靶點使用R 3.6.1 繪制條形圖。使用MCODE 模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。

1.7 核心靶點基因功能和通路富集分析 基于R 軟件使用Bioconductor 生物信息軟件包以P value＜0.05，Q value＜0.05 進行關鍵靶基因GO 功能富集分析與KEGG通路富集分析，并將結果以條形圖和氣泡圖形式輸出。

2 結果

2.1 當歸-白芍的活性成分及作用靶點篩選 在TCMSP 數據庫中設定OB ≥30%、DL ≥0.18，對當歸、白芍的有效成分進行篩選。共得到潛在活性成分14 個，其中當歸2 個，白芍13 個，包括豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇、丁子香萜、山奈酚、（+）-兒茶素、芍藥苷元、芍藥新苷、芍藥苷、芍藥苷_qt、芍藥內酯苷_qt、苯甲酰芍藥苷，活性成分β-谷甾醇為兩者共有，見表1。使用Swiss Target Prediction 數據庫篩選出342 個藥物靶點，其中當歸43 個，白芍342 個。

表1 當歸-白芍的活性成分

2.2 當歸-白芍治療治療腰椎間盤退變的關鍵靶點篩選 在OMIM、Disgenet、Genecards 數據庫進行檢索，去重后共獲得腰椎間盤退變靶點1110 個。在Venny2.1在線軟件作圖工具平臺上輸入342 個藥物靶點、1110個疾病靶點，繪制韋恩圖，兩者取交集后獲得藥物-疾病共同靶點69 個。見圖1。

圖1 當歸-白芍治療腰椎間盤退變的關鍵靶點韋恩圖

2.3 中藥-成分-靶點-疾病網絡構建及分析 將白芍-當歸中14 個潛在活性成分與69 個藥物-疾病共同靶點輸入Cytoscape 軟件中，刪除與靶點無交集的孤立成分，繪制出“藥物-成分-靶點-疾病”相互作用的網絡圖（見圖2），發現當歸-白芍有13 種活性成分，1 個活性成分靶點與疾病靶點無交集，予刪除，為（+）-兒茶素。

圖2 當歸-白芍治療腰椎間盤退變的藥物-成分-靶點-疾病相互作用網絡圖

2.4 PPI 網絡構建及核心靶點分析 構建蛋白相互作用的PPI 網絡圖，包括69 個節點，643 條邊，見圖3。通過degree 排序，將前30 個靶點使用R 3.6.1 繪制條形圖（見圖4），前10 名包括AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8、MAPK8、CCND1、JUN、FGF2、MAPK14。使用MCODE 模塊進行基因簇的分析以及核心靶點的篩選?？偣驳玫? 個基因簇和2 個核心基因，核心基因為JUN、CCR1。

圖3 當歸-白芍治療腰椎間盤退變蛋白相互作用PPI圖

圖4 當歸-白芍治療腰椎間盤退變的核心靶點

2.5 核心靶點基因功能和通路富集分析 將69個共同靶點經R 語言運行后GO 分析分子功能。GO 功能富集分析共確定79 個與分子生物功能相關的條目，主要有內肽酶活力、金屬內肽酶活性、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性、磷脂酰肌醇3-激酶活性、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性、金屬肽酶活性、跨膜受體蛋白激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、生長因子結合、蛋白磷酸酶結合、類固醇激素受體活性、絲氨酸型內肽酶活性、絲氨酸肽酶活性、磷酸酶結合、絲氨酸水解酶活性、胰島素受體底物結合、細胞因子受體結合、參與凋亡過程的半胱氨酸型內肽酶活性、核受體活性，見圖5。將69 個共同靶點經R 語言運行后共得到134 條KEGG 通路，前20 的結果形成KEGG 功能富集的條形圖（見圖6），包括TNF 信號通路、IL-17 信號通路、HIF-1 信號通路、雌激素信號通路、細胞凋亡。

圖5 當歸-白芍治療腰椎間盤退變的GO功能富集分析結果

圖6 當歸-白芍治療腰椎間盤退變的KEGG富集分析

3 討論

臨床上，眾多補益肝腎、活血通經的中藥被用于治療腰椎間盤退變導致的腰腿痛。通過數據挖掘分析中醫醫案古籍腰痛癥用藥規律，發現高頻用藥中包括當歸和白芍［4］。林浩等［5］采用含有當歸和白芍的當歸四逆湯治療腰椎間盤突出癥，發現其可降低組胺、5-羥色胺、白細胞介素6、白細胞介素1β 水平，緩解腰部疼痛、改善腰椎功能。王浩平等［6］治療腰椎間盤突出，在實施椎間孔鏡的基礎上應用含有當歸與白芍的獨活寄生湯，發現獨活寄生湯可以進一步緩解疼痛，提高療效。王曉東［7］采用獨活寄生湯治療椎間盤源性腰痛亦取得良好療效。

本研究采用網絡藥理學的方法分析當歸-白芍此藥對治療腰椎間盤退變的分子生物學機制，發現在當歸-白芍此藥對中起治療作用的活性成分包括β-谷甾醇、山奈酚、芍藥苷、豆甾醇、谷甾醇等。芍藥苷，可以抑制FasL 表達，進而抑制IL-6 及TNF-α 等炎性因子的分泌，最終起到抑制髓核細胞凋亡的作用［8］；對椎間盤纖維環細胞具有明顯的促增殖作用，Fas 配體誘導椎間盤纖維環細胞有保護作用［9］；可有效抑制纖維環細胞炎癥模型IL-1β、IL-6 和TNF-a 的表達［10］。β-谷甾醇，具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗衰老、保護肝腎功能以及調節免疫系統、骨代謝的作用［11］。山奈酚，可以降低IL-1β、IL-18、Caspase-1、Caspase-3、Caspase-9、NLRP3 等炎癥因子及促炎因子的表達，具有抗炎、抗氧化、抗菌等藥理作用，同時可以抑制大鼠蛋白尿、血肌酐和尿素氮含量，起到保護腎臟組織及功能的作用［12］。ZHU 等［13］研究發現，山奈酚可通過抵消脂多糖誘導的細胞凋亡并增加細胞增殖來增強細胞活力；還可提高SOX-9、膠原II 和蛋白聚糖等軟骨生成標志物的水平，降低基質降解酶的水平，提示其具有成骨作用；可通過降低促炎細胞因子的水平和通過抑制核轉錄因子的核易位而增加抗炎細胞因子來減輕炎癥。因此，筆者推測當歸-白芍藥對可能是通過抑制炎癥、抑制細胞凋亡、調節免疫、調節骨代謝、保護肝腎等作用治療腰椎間盤退變。

當歸-白芍藥對與腰椎間盤退變，藥物-疾病共同靶點有69 個，包括AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8、MAPK8、CCND1、JUN、FGF2、MAPK14 等。69 個共同靶點經過GO 功能富集分析后，發現與之相關的的分子生物功能包括內肽酶活力、金屬內肽酶活性、1-磷脂酰肌醇-3-激酶活性、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）活性、磷脂酰肌醇磷酸激酶活性等。PI3K 參與細胞增殖、分化、凋亡等多種細胞功能的調節，VEGFA、FGF 等多種生長因子都能啟動PI3K 的激活。AKT 是PI3K 下游主要的效應物，亦稱蛋白激酶B（PKB），可通過磷酸化多種酶、激酶和轉錄因子等下游因子，參與多種細胞功能的調節［14］。研究表明，PI3K/AKT 信號通路的激活可增加細胞外基質的含量，預防細胞凋亡，促進細胞增殖，調節細胞自噬，減輕氧化損傷以及適應低氧微環境，起到保護椎間盤的作用［15］。HUANG等［16］發現，椎間盤退變患者的髓核細胞中EGFR 表達更高，且與退變的程度成正比，此外EGFR 激活的Akt/GSK3 信號通路可促進CXCL8 的表達。CXCL8 在退變椎間盤髓核細胞中表達增高，并在腰椎間盤退變的進程中扮演了重要作用［17］，還與腰椎間盤突出引起的神經根性疼痛有關［18］。CASP3 是細胞凋亡途徑中最為關鍵的酶之一，與椎間盤退變的發表的機制有著密切的聯系［19］。PI3K/Akt/mTOR/caspase-3 信號通路與PI3K/Akt/GSK3β/caspase-3 信號通路均參與了利拉魯肽抵抗激素導致髓核細胞凋亡，起到保護椎間盤的作用［20］。HIF-1 是缺氧反應的重要調節因子，分為HIF-1α 和HIF-1β［21］，其中HIF-1α 通過調節細胞凋亡、線粒體凋亡等途徑參與椎間盤退變的發生［22］。此外，筆者發現TNF 信號通路、IL-17 信號通路、雌激素信號通路等也可能參與當歸-白芍藥對治療腰椎間盤退變的作用機制，而這些信號通路與抑制炎癥、抑制細胞凋亡、調節免疫密切相關。

綜上所述，當歸-白芍對腰椎間盤退變可能起到治療效果的活性成分包括包括β-谷甾醇、山奈酚、芍藥苷等，可能通過AKT1、EGFR、VEGFA、CASP3、CXCL8 等靶點及TNF、IL-17、HIF-1 等信號通路發揮治療作用，為進一步研究當歸-白芍治療腰椎間盤退變的作用機制奠定了基礎。