基于網絡藥理學與分子對接探討連花清瘟膠囊入血成分干預細胞因子風暴防治新型冠狀病毒肺炎的作用機制

王海娟，韓玉潔，張曉雪，李文瑾，郭秋紅,2,3*

1河北中醫學院；2河北省中藥組方制劑技術創新中心；3河北省高校中藥組方制劑應用技術研發中心，石家莊 050200

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019，COVID-19)是由冠狀病毒感染引起的，以發熱、乏力、干咳為主要臨床特征，部分患者在發病一周后迅速轉為重癥，嚴重者可進一步發展為急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、膿毒癥休克、難以糾正的代謝性酸中毒和多器官功能衰竭(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)等狀態。值得注意的是，少數早期輕癥患者，后期突然加重，導致多器官衰竭而死亡，其主要原因是引發細胞因子風暴[1]。

細胞因子風暴(cytokine storm)又稱炎癥風暴和高細胞介質癥(hypercytokinemia)，主要由于免疫系統失調后多種細胞因子迅速大量釋放，導致肺組織廣泛水腫，引起急性肺損傷，與COVID-19的不良預后密切相關，是疾病進展的重要轉折點，最終可發展為ARDS、MODS，甚至死亡[2,3]。由此可見，通過抗炎治療可能是遏制細胞因子風暴防治COVID-19的一種有效方法。

連花清瘟膠囊(簡稱“連花清瘟”)作為呼吸系統傳染病突發公共衛生事件代表中成藥，主要由銀翹散和麻杏甘石湯化裁而來，包括金銀花、連翹、大黃等13味中藥，具有清瘟解毒，宣肺泄熱的功效。已有研究證實[4]，連花清瘟通過調節炎癥細胞因子表達，明顯改善患者發熱、咳嗽、咳痰、氣促、乏力等相關癥狀，使轉重比率明顯下降，對治療COVID-19具有十分重要的意義。本研究將以連花清瘟入血成分為基礎，通過網絡藥理學與分子對接探討干預細胞因子風暴防治COVID-19可能作用機制，以期為臨床應用提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 連花清瘟入血成分靶點預測

通過查閱文獻確定連花清瘟入血成分[5]，借助中藥系統藥理學分析平臺(TCMSP，https://tcmspw.com/tcmsp.php)數據庫檢索連花清瘟入血成分相關靶點，利用中藥分子機制生物信息學分析工具(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)數據庫對連花清瘟入血成分相關靶點進行補充。通過UniProt(https://www.uniprot.org/)數據庫對靶點進行標準化處理，將其轉換成與之相對應的基因名稱。

1.2 疾病靶點的篩選及韋恩圖

利用GeneCards(https://www.genecards.org/)數據庫，OMIM(https://www.omim.org/)以及Drugbank(https://go.drugbank.com/)數據庫以“Novel coronavirus pneumonia”“Cytokine storm”為關鍵詞收集疾病相關蛋白基因，刪除重復靶基因，作為COVID-19與細胞因子風暴疾病靶點，并利用在線韋恩分析工具Venny 2.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)映射篩選出連花清瘟入血成分對COVID-19以及細胞因子風暴交集作用靶點。

1.3 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡構建與分析

獲取的連花清瘟入血成分以及與疾病交集靶點導入Cytoscape 3.8.0軟件，構建網絡關系圖，并利用“Analyze Network”功能對其進行拓撲分析，獲取主要有效化合物。

1.4 構建蛋白相互作用(PPI)網絡

將連花清瘟入血成分靶點與疾病靶點相交集部分導入String數據庫進行檢索，把蛋白物種設置為“Homo sapiens”，最低相互作用閾值為0.4，隱藏單獨靶點，其余參數不變，獲取蛋白相互作用數據文件，將數據導入Cytoscape 3.8.0進行拓撲分析，根據degree值制作PPI網絡圖，并以degree值大于中位數篩選出核心靶點。

1.5 GO富集和KEGG通路分析

選取連花清瘟入血成分干預細胞因子風暴防治COVID-19靶點，導入生物學信息注釋數據庫DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)，分析基因本體論(GO)富集和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路，物種與背景均設置為“Homo sapiens”(P<0.01)進行操作，并按照count進行排序，篩選排名靠前的GO富集和KEGG通路，并通過Origin 2019軟件工具，對富集分析結果進行可視化作圖。

1.6 構建“靶點-通路”網絡圖

通過篩選得到的連花清瘟入血成分與疾病共同靶點，與KEGG信號通路一同導入Cytoscape 3.8.0軟件，繪制網絡圖。

1.7 成分-靶點分子對接

基于“中藥-成分-靶點-疾病”網絡與PPI蛋白互作網絡分析，根據degree值選取排名前5個成分與前5個靶基因進行分子對接。首先從ZINC(http://zinc.docking.org/)數據庫下載核心化合物相關mol2格式文件，通過PDB(https://www.rcsb.org/)蛋白數據庫下載含有原配體的3D結構PDB格式文件，應用PyMol軟件刪除蛋白水分子，并拆分蛋白與配體，利用AutoDock Vina 1.1.2進行分子對接驗證，最后用PyMol對結果進行可視化處理并作圖。

1.8 檢索多器官組織損傷、免疫損傷和SARS相關靶點

通過GeneCards(https://www.genecards.org/)、OMIM(https://www.omim.org/)、TTD(http://db.idrblab.net/ttd/)數據庫，以“SARS”“Liver injury”“Renal injury”“Lung injury”“Cardiovascular injury”“Immune injury”為檢索詞，收集多器官組織損傷、免疫損傷相關靶點，利用在線工具Draw Venn Diagram分析連花清瘟入血成分與多器官組織損傷、免疫損傷和SARS之間的交集靶點，制作韋恩圖。并分別將其交集靶點導入DAVID數據庫，進行KEGG通路分析，通過Origin對結果進行可視化處理。

2 結果

2.1 篩選連花清瘟入血成靶點與疾病靶點并制作韋恩圖

通過文獻查閱確定連花清瘟22個入血成分，剔除無靶點的成分，一共17個連花清瘟入血活性成分(見表1)，借助TCMSP和BATMAN-TCM數據庫共收集得到237個靶點。利用GeneCards、OMIM以及Drugbank數據庫查找COVID-19及細胞因子風暴相關靶點，其中收集COVID-19靶點451個，細胞因子風暴靶點303個，篩除重復靶點得到685個。將連花清瘟入血成分靶點與疾病靶點導入Venny 2.0進行繪制韋恩圖，如圖1所示。

表1 連花清瘟入血成分Table 1 Absorbed components of Lianhua Qingwen

圖1 成分與疾病靶點交集分布Fig.1 Intersection distribution of components and disease targets

2.2 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡圖與核心化合物

17個入血成分和47個交集靶點導入Cytoscape軟件構建“中藥-成分-靶點-疾病”網絡圖，如圖2所示，其中網絡共有74個節點，176條邊，藍色代表靶點，黃色代表成分，紅色代表疾病與中藥名稱；利用內部“Analyze Network”功能，并根據degree值進行分析，度值越高，說明其在網絡中越重要。結果顯示大黃素(emodin)、芒柄花黃素(formononetin)、蘆丁(rutin)、沒食子酸(gallic acid)、甘草素(liquiritigenin)成分在網絡中排名較高，可能是連花清瘟入血成分干預細胞因子風暴防治COVID-19重要活性成分。

圖2 “中藥-成分-靶點-疾病”網絡Fig.2 “Herbs-components-targets-disease” network

2.3 PPI網絡制作及篩選關鍵靶點

將17個入血成分靶點與疾病靶點相映射得到47個相交集靶點，導入String數據庫進行PPI網絡分析，設置蛋白互作綜合得分> 0.4，隱藏單獨靶點，其余參數不變，得到PPI網絡信息，導入Cytoscape軟件進行網絡拓撲分析，根據degree值制作PPI網絡圖，如圖3所示，其中節點表示每個蛋白，節點與節點之間的連線表示蛋白之間的相互作用關系；以“degree >中位數(20)”篩選出核心靶點22個(見表2)，連花清瘟入血成分可能與核心靶點結合而發揮其藥理作用。

表2 連花清瘟入血成分關鍵靶點信息Table 2 Information on the key targets of absorbed components of Lianhua Qingwen

圖3 PPI蛋白互作網絡Fig.3 PPI protein interaction network

2.4 GO富集和KEGG通路分析

把得到的47共同靶點導入DAVID數據庫進行GO生物功能注釋，獲得GO條目174個(P<0.01)，分別包括生物過程(BP)129個，細胞組成(CC)15個，分子功能(MF)30個，根據count值選取各自排名前10個條目繪制柱狀圖，如圖4所示，其中生物過程主要與炎癥反應(inflammatory response)、信號轉導(signal transduction)、免疫反應(immune response)等相關；細胞組成主要富集在細胞質(cytoplasm)、核(nucleus)、線粒體(mitochondrion)等；分子功能主要涉及在蛋白結合(protein binding)、細胞因子活性(cytokine activity)、蛋白激酶活性(protein kinase activity)等。KEGG通路分析共富集于83個條目(P< 0.01)，篩選排名靠前的20個條目進行可視化分析，繪制氣泡圖，如圖5所示，主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-κB signaling pathway)等。

圖4 GO功能分析Fig.4 GO functional analysis

圖5 KEGG通路分析Fig.5 KEGG pathway analysis

2.5 構建“靶點-通路”網路圖

47個靶點，83條KEGG通路導入Cytoscape軟件構建“靶點-通路”網絡圖，如圖6所示，其中網絡共有132個節點，790條邊，利用內部的“Analyze Network”功能進行分析，在47個靶點中PIK3CG、AKT1、RELA、TNF、IKBKB、JUN、IL6、TP53、PRKCA、MAPK14、PRKCB、IL1B、TGFB1、CASP3、GSK3B、EGF、CDKN1B、BAX、BCL2L1、CSF2、NOS2共參與10條以上信號通路，為富集較多的基因，提示這些基因與連花清瘟入血成分作用機制高度相關。

圖6 “靶點-通路”網絡Fig.6 “Targets-pathways” network

2.6 分子對接驗證結果分析

本研究將emodin、formononetin、rutin、gallic acid、liquiritigenin核心化合物與AKT1、IL-6、TP53、JUN、TNF核心靶點進行分子對接驗證，結果表明化合物與靶點有良好的結合能力，其結合能越小表示結合活性越高，化合物越容易與靶點結合。結果見表3所示，核心化合物emodin分別與AKT1、JUN、TNF、ACE2結合能均小于-8 kcal/mol；Liquiritigenin與TNF結合能最低，其次為emodin與JUN，表明liquiritigenin、emodin與TNF、JUN結合活性最強；而emodin通過結合位點MET-111、ASN-114形成氫鍵作用。分子對接情況如圖7所示。

圖7 化合物與靶點分子對接圖Fig.7 Molecular docking diagram of compounds and target注：a.大黃素-JUN；b.甘草素-TNF；c.芒柄花黃素-TNF；d.蘆丁-AKT1。Note: a.Emodin-JUN;b.Liquiritigenin-TNF;c.Formononetin-TNF;d.Rutin-AKT1.

表3 化合物與靶點分子對接結果Table 3 Molecular docking results of compound and target

2.7 連花清瘟入血成分對多器官組織損傷、免疫損傷和SARS的作用

通過數據庫檢索“Liver injury”相關靶點7 842個，“Renal injury”靶點6 685個，“Lung injury”靶點8 484個，“Cardiovascular injury”靶點6 513個，“Immune injury”靶點7 343個，“SARS”靶點1 688個。為了進一步分析連花清瘟入血成分對多器官組織損傷以及免疫損傷是否有調控作用，把連花清瘟入血成分靶點與器官組織損傷、免疫損傷靶點之間取交集，并制作韋恩圖，如圖8所示，交集靶點個數與比例見表4。

圖8 連花清瘟入血成分與多器官組織損傷和免疫損傷、SARS韋恩圖Fig.8 Venn diagram of absorbed components of Lianhua Qingwen and multiple organ tissue injury,immune injury and SARS注：a.連花清瘟入血成分；b.肺損傷；c.肝損傷；d.腎損傷；e.心血管損傷.f.免疫損傷；g.SARS。Note: a.absorbed components of Lianhua Qingwen;b.Lung injury;c.Liver injury;d.Renal injury;e.Cardiovascular injury;f.Immune injury;g.SARS.

表4 連花清瘟入血成分與多器官組織損傷、免疫損傷和SARS靶點信息Table 4 Target information of absorbed components of Lianhua Qingwen and multiple organ tissue injury,immune injury and SARS

將連花清瘟入血成分與SARS得到的76個交集靶點，多器官組織損傷130個交集靶點，免疫損傷133個交集靶點，分別導入DAVID數據庫進行KEGG通路分析，并篩選各自排名靠前的12個條目進行繪制條形圖，如圖9所示，結果顯示多器官組織損傷、免疫損傷和SARS主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)等。

圖9 連花清瘟入血成分與SARS、多器官組織損傷和免疫損傷KEGG通路分析Fig.9 KEGG pathway analysis of absorbed components of Lianhua Qingwen and multiple organ tissue injury,immune injury and SARS

3 討論

本研究通過查閱文獻得出17個連花清瘟有效入血成分，利用網絡拓撲學分析得到emodin、formononetin、rutin、gallic acid、liquiritigenin核心成分；獲得47個連花清瘟入血成分干預細胞因子風暴防治COVID-19潛在作用靶點，包括AKT1、IL-6、TP53、JUN、TNF、CASP3、IL1B、EGF等22個核心靶點。為了更好的詮釋靶點涉及的功能，本研究對47個靶點進行了GO富集分析和KEGG通路分析，結果發現連花清瘟入血成分作用機制主要富集RNA聚合酶Ⅱ啟動轉錄正調控(positive regulation of transcription from RNA polymerase Ⅱ promoter)、炎癥反應(inflammatory response)、NF-κB轉錄因子活性正調控(positive regulation of NF-KappaB transcription factor activity)等與炎癥相關的生物過程；KEGG通路分析主要涉及癌癥通路(pathways in cancer)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、MAPK信號通路(MAPK signaling pathway)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、HIF-1信號通路(HIF-1 signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-κB signa-ling pathway)等。分子對接顯示連花清瘟入血成分中emodin、formononetin、rutin、gallic acid、liquiritigenin核心化合物與AKT1、IL-6、TP53、JUN、TNF核心靶點有良好的結合能力，推測連花清瘟入血成分可能通過調節相關靶點，抑制炎癥細胞因子分泌，阻斷SARS-CoV-2病毒與ACE2蛋白結合，防止SARS-CoV-2感染人體細胞，進而發揮干預細胞因子風暴的效果。

為了進一步分析連花清瘟入血成分對多器官組織損傷以及免疫損傷是否有調控作用，通過數據庫檢索多器官組織損傷以及免疫損傷相關靶點，并與連花清瘟入血成分靶點之間取交集，結果顯示連花清瘟膠囊入血成分與多器官組織損傷及免疫損傷相交集靶點比例為1.6%～2%。因SARS病毒與冠狀病毒具有高度的同源性，把連花清瘟入血成分與SARS病毒兩者之間取交集，得出連花清瘟入血成分與SARS交集靶點比例為4.3%。提示連花清瘟入血成分有調節免疫，保護組織器官以及抗病毒的可能。KEGG通路分析結果顯示多器官組織損傷、免疫損傷和SARS主要涉及癌癥通路、PI3K-Akt、MAPK、TNF、HIF-1等信號通路。故本研究根據靶點預測，及KEGG通路分析，將從清除抗原，調節免疫系統，保護組織器官三個方面探討連花清瘟入血成分干預細胞因子風暴防治COVID-19的作用。

3.1 清除抗原—抗病毒

新型冠狀病毒是COVID-19的病原體，廣州醫科大學第一附屬醫院呼吸疾病國家重點實驗室研究發現連花清瘟體外可明顯抑制新型冠狀病毒活性，減少細胞胞膜及胞漿中病毒含量，抑制細胞因子過度激活。研究發現，ACE2是SARS-CoV-2宿主細胞受體，SARS-CoV-2與ACE2 結合是病毒感染人體細胞的重要環節，SARS-CoV-2感染后進入肺泡細胞，短期內復制大量細胞因子，最終形成細胞因子風暴引發炎癥[6,7]。Ho等[8]發現大黃素通過阻斷SARS-CoV蛋白與ACE2受體結合來抑制SARS-CoV感染，從而起到抗病毒作用。已有研究表明，蘆丁200mg/kg時，對流感小鼠肺指數抑制率為27.3%，具有明顯抗流感病毒的作用，而對流感病毒抑制作用可能在釋放和擴散階段[9,10]。MAPK是一種已知可被多種病毒激活的主要細胞信號通路，此前有關人冠狀病毒感染的報道顯示，p38 MAPK通路激活，其下游調控蛋白磷酸化增強，促進促炎細胞因子的產生，并導致細胞因子風暴[11]。Wang等[12]通過體內和體外實驗發現，大黃酸可以抑制甲型流感病毒(IAV)吸附和復制，可能是通過抑制MAPK以及NF-κB信號通路有關。已經證實甘草主要成分甘草酸可以抑制SARS-CoV病毒在體外培養Vero細胞內的復制，還能抑制病毒在復制周期早期階段的吸附和滲透[13]。以上說明連花清瘟入血成分具有廣譜抗病毒作用，可能通過抑制病毒繁殖，進一步從源頭遏制細胞因子風暴發生。

3.2 免疫調節—抑制炎癥風暴

免疫紊亂是細胞因子風暴的核心，病毒進入機體后，使免疫調控網絡失衡，導致促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間平衡失調，使機體走向一種高炎癥狀態，進而引發細胞因子風暴。通過韋恩圖發現連花清瘟入血成分與免疫損傷有133個共同靶點，由此可知連花清瘟入血成分可能通過免疫調節達到抑制炎癥風暴。根據已有研究發現，COVID-19患者外周血CD4+和CD8+T淋巴細胞顯著減少，但CD4+T淋巴細胞Th17亞群增加，CD8+T淋巴細胞含有更高濃度的細胞毒性顆粒，提示在某種程度上，病人免疫程度損傷嚴重[14]。IL-6是一種促炎細胞因子，IL-6分泌有助于輔助評估COVID-19嚴重程度，且IL-6水平動態變化可作為重癥新冠肺炎患者病情監測的指標[15]。TNF-α主要有單核巨噬細胞分泌的小分子蛋白，釋放炎性因子參與炎癥反應，進而加重疾病發生發展。已有研究發現激活NF-κB通路，導致TNF-α和IL-6等促炎細胞因子的過度表達，阻斷NF-κB信號通路不僅可以抑制病毒傳播，還可以抑制相關炎癥發展[16]。甘草酸在綿羊肺炎支原體(MO)感染中，可以通過增加MO感染后的巨噬細胞增殖，從而起到免疫調控作用[17]。大黃素作為大黃的主要成分之一，除了能抑制炎癥早期細胞因子外，還能抑制炎癥級聯反應，降低“次級”炎癥細胞因子表達，通過抑制NF-κB p65磷酸化，能使IL-6、TNF-α在外周血中表達降低，抑制LPS誘導的巨噬細胞釋放細胞因子，具有較理想抗炎功效[18,19]。已有研究表明芒柄花黃素可以降低對腦組織炎癥因子表達，主要是通過控制SphK1/SIP信號通路的激活，從而抑制NF-κB信號通路，進一步改善炎癥因子對腦組織的損傷[20]。Liu等[21]觀察發現紅景天苷能使血清中促炎細胞因子和肺部炎癥顯著降低，明顯抑制TNF-α、IL-1β、IL-6促炎細胞因子，使抗炎細胞因子IL-10水平明顯升高。以上表明，連花清瘟入血成分通過抑制NF-κB信號通路，下調促炎細胞因子表達，上調抗炎細胞因子水平，使促炎細胞因子與抗炎細胞因子之間平衡，從而起到干預細胞因子風暴作用。

3.3 組織器官保護

細胞因子風暴的后果是多器官功能衰竭，過量的細胞因子釋放會導致組織損傷，嚴重者導致死亡。在臨床生化檢驗指標中發現，COVID-19主要損傷器官是肺，其次對心、肝、腎也有不同程度的損傷[22]。根據連花清瘟入血成分與各臟器損傷的靶點制作韋恩圖可知，連花清瘟入血成分對各臟器損傷都有交集靶點，可能通過這些靶點減輕組織器官損傷，增強機體免疫功能。PI3K屬于胞內磷脂酰肌醇激酶，Akt是PI3K下游非常重要的活性靶標，屬于一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PI3K/Akt信號通路在LPS誘導的慢性肝損傷中表達升高，顯著影響NF-κB信號通路，導致細胞轉錄改變，最終導致肝功能障礙；有研究證明苦杏仁苷對細胞中PI3K和磷酸化AKT表達降低，表明苦杏仁苷通過抑制PI3K/AKT和NF-κB信號通路，增強抗炎能力，對肝損傷具有顯著保護作用[23]。Hu等[24]研究發現LPS誘導TNF-α、IL-1、IL-6炎癥反應是急性肺損傷(ALI)惡化的關鍵因素，因此，抑制促炎細胞因子過量產生和表達來降低LPS誘導ALI不可忽視。大黃素在重癥急性胰腺炎(SAP)肺損傷大鼠模型中，通過下調NF-κB、TNF-α、IL-1β炎癥表達，起到保護SAP肺損傷，保護機體的作用[25]。說明連花清瘟入血成分，通過抑制PI3K/AKT、NF-κB炎癥信號通路，具有減輕組織器官損傷的作用。

綜上所述，通過網絡藥理學與分子對接對連花清瘟入血成分進行探究性研究，表明連花清瘟入血成分具有多成分、多靶點、多通路的特點，能通過調節相關細胞因子及信號通路發揮清除抗原、調節免疫和保護組織器官的作用。該研究為連花清瘟膠囊有效防治COVID-19提供了物質基礎及理論依據。