網絡藥理學技術預測昆侖雪菊總黃酮治療非小細胞肺癌作用及初步驗證研究

伊麗米熱·吾甫爾，庫熱西·玉努斯，王志濱，國魯源，吳桂霞*

1新疆醫科大學基礎醫學院；2新疆醫科大學維吾爾醫學院；3新疆醫科大學第二臨床醫學院，烏魯木齊 830011

肺癌是全球最常見的癌癥之一。大約85%的肺癌是非小細胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)[1]。臨床對于肺癌的主要治療手段有手術、化療、放療和生物治療等。完全手術切除雖有效但前提是該疾病在醫學上可操作且可適當分期[2]。放、化療藥物具有非特異性，往往產生嚴重的毒副作用。中藥因具有多靶點、多途徑、多效應的作用特點在腫瘤的預防及治療領域發揮了獨特的作用。已有多種中藥成分及其提取物被發現具有較好的抗腫瘤作用，如苦參堿、三羥異黃酮、紫杉醇等，其中一些已廣泛地應用于臨床[3-5]。昆侖雪菊又被稱作兩色金雞菊(CoreopsistinctoriaNutt.)。現代藥效學研究表明新疆昆侖雪菊富含多酚類、黃酮類、多糖等多種化學成分[6]，其中黃酮類具有降血脂、調節血糖、抗腫瘤等重要的藥理作用[7,8]。但由于黃酮類成分多、靶點多、作用途徑多，使其治療疾病的分子機制研究存在一定困難。

網絡藥理學(network pharmacology)是基于系統生物學和多向藥理學的研究方法，通過構建“藥物-靶點-疾病”的多層次相互作用網絡，從整體水平上分析藥物作用靶點及作用機制[9]。本文通過應用網絡藥理學結合體外細胞實驗，分析昆侖雪菊總黃酮(Kunlun chrysanthemum total flavonoids，KCTF)對NSCLC的抗瘤成分及作用機制，為其后續的藥物研發和臨床應用提供實驗依據。

1 材料

1.1 細胞

人非小細胞肺癌細胞(A549)由新疆醫科大學協同創新細胞庫提供。

1.2 藥品與試劑

DMEM液體培養基和胎牛血清(賽默飛世爾科技有限公司)；Annexin V-FITC/PI試劑盒(美國BD公司)；TRIzol Reagent(賽默飛世爾科技有限公司)；反轉錄試劑盒(賽默飛世爾科技公司)；QuantiNova SYBR Green染料法PCR試劑盒(凱基生物公司)；RIPA裂解液(碧云天生物技術公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(碧云天生物技術公司)；兔單抗Bax、兔單抗Bcl-2(Abcam公司，ab32503、ab32124)；小鼠單抗β-actin(武漢博士德生物工程有限公司，BM0627)；昆侖雪菊(新疆雪菊生物科技有限公司，生產許可證號：QS650114020007)。

1.3 儀器

NovoCyte D2060R流式細胞儀(ACEA公司)；MF53倒置熒光顯微鏡(德國萊卡公司)；ABI 7500 Real-Time PCR儀(Applied Biosystems公司)。

2 方法

2.1 KCTF的提取及純化分離

60 ℃烘干箱內烘干雪菊，研磨后過篩備用，按照1∶60投料比，加入80%的乙醇，超聲萃取儀超聲1.5 h后過濾，共三次。濾液經旋轉蒸發儀蒸發濃縮得其浸膏。將粗黃酮浸膏裝入大孔樹脂的玻璃層析柱中，經12 h浸泡后，60%乙醇洗脫，收集洗脫液，旋蒸后得KCTF純化物，經紫外分光光度計法測其總黃酮含量。

2.2 雪菊-類黃酮廣靶代謝組分析

用600 μL提取液(50%甲醇含0.1%甲酸)復溶總黃酮純化物，渦旋30 s后冰水浴超聲15 min，4 ℃，12 000 rpm離心15 min，取上清于2 mL進樣，UPLC BEH C18色譜柱(1.7 μm，2.1 mm×150 mm)上機檢測。柱溫箱溫度設為40 ℃，自動進樣器溫度設為8 ℃，進樣體積為2 μL。

2.3 應用網絡藥理學進行靶點預測及網絡構建

2.3.1 KCTF靶點預測

通過HPLC法得到KCTF的化合物組分，從TCMPS(https：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)中對KCTF的主要化合物分子進行吸收、分布、代謝、排泄和毒性(ADME/T)預測和評價。對符合藥物口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%，類藥性值(drug-like，DL)≥0.18的成分進行篩選,得出總黃酮的有效活性成分。再通過TCMSP平臺預測上述有效活性成分的靶點。將所有靶點通過STRING(https：//www.string-db.org/)數據庫以“Homo sapiens”(人屬)為關鍵詞進行基因-蛋白名稱轉換。

2.3.2 NSCLC相關靶點網絡構建[10]

通過DiSGeNET(http：//www.disgenet.org/)，以“Non-Small Cell Lung Carcinoma”為關鍵詞檢索NSCLC相關靶點，獲得所有已知的與NSCLC有關的基因靶點。借助STRING數據庫，輸入上述關鍵靶點，物種限定設置為人類。將查詢到的與NSCLC有關的靶點與KCTF有效活性成分的作用靶點取交集，篩選KCTF治療NSCLC的潛在靶點。應用STRING數據庫，輸入上述潛在靶點，隨后進行PPI網絡構建與分析，獲取關鍵靶點。

2.3.3 關鍵靶點的KEGG通路富集分析

通過DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)對關鍵靶點進行KEGG通路富集分析，并通過OmicShare(http://www.omicshare.com)平臺對結果進行可視化處理。

2.3.4 總黃酮-靶點-通路網絡構建

應用Cytoscape 3.6.0軟件繪制關鍵靶點-通路網絡和KCTF化合物-關鍵靶點網絡。最后將KCTF化合物-關鍵靶點網絡和關鍵靶點-通路網絡進行合并。建立KCTF-靶點-通路網絡。通過Network analyzer分析評價網絡的拓撲結構特性。

2.4 昆侖雪菊總黃酮對A549細胞的抗瘤作用

2.4.1 細胞培養

A549細胞復蘇后加入到10%的DMEM培養基中，置入37 ℃、5%CO2的培養箱中培養，待細胞進入快速生長期后傳代培養。

2.4.2 CCK8法檢測細胞活性

A549細胞接種于96孔板中(1×105/孔)，經48 h細胞融合時進行實驗。不同濃度的雪菊總黃酮提取物(400、800、1 600、2 400、3 200 μg/mL)的藥物100 μL，以DDP作為對照組，繼續培養24 h后，每孔加入CCK8 100 μL，將培養液傾去，酶聯儀490 nm波長測各孔的OD值。按照如下公式計算細胞抑制率，半數抑制濃度(inhibitory concentration 50，IC50)值由IC50值計算軟件求出。實驗重復3次。

細胞生長抑制率=[1-OD實驗/OD對照]×100%

2.4.3 流式細胞儀檢測細胞凋亡

A549細胞接種至6孔板中，待細胞達到對數生長期后，分為三個處理組：陰性對照組；雪菊總黃酮干預組；陽性對照組(順鉑，DDP)，干預處理細胞48 h，胰酶消化后收集細胞懸液，離心5 min；PBS洗滌、重懸后，取100 μL的細胞懸液與Annexin V-FITC 5 μL和PI 5 μL混勻后避光，室溫孵育45 min；流式上機檢測，CELL Quest軟件分析。

2.4.4 細胞劃痕實驗觀察細胞遷移

按“2.4.3”干預細胞48 h后，胰酶消化細胞；用完全培養基制備成1×105/mL單細胞懸液，細胞接種于培養皿中間的2孔插件Insert(70 μL/孔，即每孔7×104/孔)，細胞長滿Insert區域后用鑷子移除Insert。每隔12 h拍照記錄。根據收集圖片數據分析實驗結果。

2.4.5 RT-qPCR檢測A549細胞Bax、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達

收集“2.4.3”中平行處理的各組A549細胞，Trizol提取總RNA，按逆轉錄試劑盒說明書，獲得cDNA后，以SYBRGreen熒光染料試劑盒進行實時熒光定量PCR擴增，反應條件設置為95 ℃預變性2 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸15 s，共設置40個循環。用2-△△ct法測定目的基因相對表達量。相關引物序列見表1。

表1 Real-Time PCR所用引物序列表Table 1 Primer sequences used for Real-Time PCR

2.4.6 Western blot檢測Bax、Bcl-2的表達

收集“2.4.3”中平行處理的各組A549細胞，提取細胞總蛋白，測定蛋白濃度，電泳分離40 μg蛋白質，轉移至PVDF膜，用含5%脫脂奶粉的TBST封閉PVDF膜，室溫2 h。一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，TBST充分洗滌PVDF膜5次，5 min/次。化學發光法曝光至醫用X膠片上，灰度值掃描后統計處理，重復三次。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 KCTF活性成分篩選

通過HPLC方法對KCTF進行廣靶代謝組分析，共得出68個黃酮化合物，根據化合物的分子量(MW)、口服生物利用度(OB)、類藥性(DL)從TCMPS獲得KCTF的23個活性藥效成分(OB≥30%，DL≥0.18)，其中表兒茶素沒食子酸酯、表沒食子兒茶素、芹菜素，紫云英苷4個成分含量較高將其納入。共得到27個總黃酮的成分。KCTF活性化合物的化學信息(見表2)。

表2 KCTF主要的活性化合物Table 2 Active ingredients of KCTF

續表2(Continued Tab.2)

3.2 KCTF干預NSCLC潛在靶點選擇

KCTF的27個活性成分(見表2)從TCMSP數據庫和ETCM數據庫中預測到891個靶點，通過STRING數據庫進行基因-蛋白名稱轉換及去除重復的靶基因，共得到303個化合物靶點。將DiSGeNET數據庫搜索的靶點信息與NSCLC相關的靶點取交集得到217個KCTF對NSCLC潛在的作用靶點(見圖1)。

圖1 疾病靶點-藥物靶點韋恩圖Fig.1 Disease targets-drug targets Venn diagram

3.3 PPI網絡構建

將217個KCTF對NSCLC潛在的作用靶點導入STRING數據庫，選擇物種為人類，排除游離的無相互作用蛋白，將minimum required interaction score設置為大于0.998，獲得蛋白質相互作用關系，邊越粗意味著combine score越大，根據combine score的大小制作出68個關鍵蛋白節點(見圖2)。

圖2 PPI網絡Fig.2 PPI network

3.4 KEGG通路富集分析結果

KEGG通路富集分析結果顯示，88個通路被富集，P<0.01的通路有76條，依據P值大小，選擇P值最小即相關度最高的20位，包括細胞凋亡(apoptosis)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、細胞周期(cell cycle)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等。總黃酮治療NSCLC關鍵靶點KEGG通路富集結果見圖3。說明總黃酮有效成分的作用靶點分布在不同的信號通路，通過多成分、多靶點互相調節發揮治療NSCLC的作用。

圖3 KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis

3.5 KCTF-靶點-通路網絡分析

采用Cytoscape 3.6.0構建KCTF-靶點-通路網絡網絡模型(見圖4)，綠色三角形代表化合物，黃色圓形代表作用靶點，藍色多邊形代表通路。由KEGG反向分析得到的前20個通路中共有65個關鍵靶點。在KCTF的活性成分中表沒食子兒茶素沒食子酸酯((-)-epigallocatechin gallate)、槲皮素(quercetin)、芹菜素(apigenin)、木犀草素(luteolin)、漆黃素(fisetin)、黃芩素(baicalein)、金合歡素(acacetin)的自由度較高，具有較多的作用靶點，可能在KCTF治療NSCLC的過程中起到較為核心的作用。在關鍵靶點方面，HSP90AA1、TP53、AKT1、CCND1、RELA、CDKN1A、MAPK1、CDK4、RB1、CASP3、MDM2、EGFR、CASP9、BAX的自由度均大于15，有較多的活性成分配體。在前20條通路中自由度較大的通路為癌癥的途徑(pathways in cancer)、細胞凋亡(apoptosis)、PI3K-Akt信號通路(PI3K-Aktt signaling pathway)、HTLV-I感染(HTLV-I infection)、病毒致癌(viral carcinogenesis)、細胞周期(cell cycle)、p53信號通路(p53 signaling pathway)、FoxO信號通路(FoxO signaling pathway)自由度均大于20，其中PI3K-Akt信號通路的自由度為28。KCTF有效成分作用靶點分布于的代謝通路，相互協調。

圖4 KCTF-靶點-通路網絡Fig.4 KCTF-target-pathways network

3.6 CCK8法檢測KCTF對A549細胞的生長抑制作用

CCK8的結果表明，KCTF對A549細胞的生長有明顯的抑制作用，且濃度越高對細胞的增殖抑制作用越強；KCTF干預A549細胞24、48及72 h后，計算IC50值(24 h：2 408.09 μg/mL；48 h：1 613.09 μg/mL；72 h：1 338.48 μg/mL)，結果表明KCTF對A549細胞的增殖抑制作用具有一定的時間依賴性。根據上述實驗結果，將KCTF干預濃度確定為1 000 μg/mL，干預時間確定為48 h，用于后續實驗(見表3)。

表3 KCTF對A549細胞的生長抑制作用Table 3 Inhibitory effect of KCTF on A549

3.7 流式細胞檢測KCTF對A549細胞凋亡的影響

流式的結果表明，與陰性對照組相比，KCTF干預組(1 000 μg/mL)干預A549細胞后明顯促進了細胞的凋亡，差異有統計學意義(P<0.01)(見表4、圖5)。

圖5 KCTF對A549細胞凋亡的影響Fig.5 The apoptotic effect of KCTF on A549 cells注：A：陰性對照組；B：KCTF干預組；C：陽性對照組。Note:A:Negative control group;B:KCTF intervention group;C:Positive control group.

表4 KCTF對A549細胞凋亡的影響Table 4 The apoptotic effect of KCTF on A549

3.8 細胞劃痕觀察KCTF對A549細胞遷移的影響

細胞劃痕后在0、12、24、36 h分別在鏡下觀察三組細胞劃痕寬度恢復的情況，空白對照組基本保持原有的遷移能力，KCTF干預組(1 000 μg/mL)及陽性對照組在12、24、36 h細胞遷移受到抑制明顯，說明KCTF對A549細胞有抑制腫瘤細胞遷移的能力(見表5)。

表5 KCTF對A549細胞遷移的影響Table 5 Effect of KCTF on A549 cell

3.9 RT-qPCR檢測A549細胞中Bax、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達水平

與陰性對照組比較，KCTF干預組(1 000 μg/mL)Bax的mRNA表達水平上調，差異具有統計學意義(P<0.05)，而Bcl-2和MMP-2的mRNA表達水平與陰性對照組比較差異無統計學意義，但有下調趨勢(P>0.05)(見表6)。

表6 KCTF對A549細胞中Bax、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達水平的影響Table 6 The effect of KCTF on the expression of Bax and Bcl-2 mRNA in A549

3.10 Western blot檢測A549細胞中Bax/Bcl-2蛋白的表達水平

如表7所示，與陰性對照組相比(n=3)，KCTF干預組(1 000 μg/mL)對A549細胞內促凋亡因子Bax的水平顯著升高(P<0.01)，抗凋亡因子Bcl-2的表達明顯下調(P<0.01)，Bax/Bcl-2的比值上調，表明KCTF對A549細胞可能是通過上調Bax/Bcl-2的比值的表達來促進NSCLC的凋亡，從而抑制腫瘤的生長(見圖6)。

表7 KCTF對A549細胞中Bax/Bcl-2蛋白表達水平的影響Table 7 The effect of KCTF on the expression of Bax and Bcl-2 protein in A549

圖6 KCTF對A549細胞中Bax/Bcl-2蛋白表達的影響Fig.6 The effect of KCTF on the expression of Bax and Bcl-2 protein in A549 cells注：A：陰性對照組；B：KCTF干預組；C：陽性對照組。Note:A:Negative control group;B:KCTF intervention group;C:Positive control group.

4 討論

廣泛存在于各種植物中的黃酮化合物是一種很強的抗氧化劑，能有效地清除體內自由基，具有抗腫瘤、降血壓、抗衰老等重要的藥理作用。本研究通過HPLC技術對昆侖雪菊中的總黃酮進行成分分析，結果顯示相對含量較高的有表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素、木犀草素、兒茶素等，已有大量的研究結果表明槲皮素、木犀草素等黃酮類對多種實體瘤有較好的抗瘤活性[11,12]。體外的細胞實驗已表明，昆侖雪菊總黃酮對人結腸癌HCTI16細胞、Caco-2細胞具有明顯的增殖抑制作用[13]。但中藥多成分、多靶點、多途徑協同發揮藥效的作用特點，使其作用機制的現代化研究存在困難。

2007年Hopkins[14]提出的網絡藥理學，將藥物、靶點、疾病的關系在網絡中表現出來。利用網絡藥理學可以系統分析中藥的組成成分，挖掘藥物與疾病的共同作用靶點，進而分析生物學功能和信號通路，這種整體、系統的研究模式與中醫藥的整體觀理論是相一致的。

在本研究中，通過TCMSP對KCTF的68個成分進行篩選，預測27個黃酮成分的891個靶點，與NSCLC靶點交集后，獲得217個KCTF干預NSCLC的可能靶點。其中MAPK1、EGFR、Tp53、Akt、Bax、Bcl-2、Caspase 3等重要靶點與多個化學成分存在關系，表明KCTF各活性成分間存在著密切的協同關系。為進一步對KCTF干預NSCLC的作用機制進行分析，將二者關系進行PPI網絡構建與KEGG生物通路富集分析，結果表明PI3K-Akt信號通路、Bax/Bcl-2抗凋亡信號通路、p53信號通路、MAPK信號通路等與KCTF抗瘤作用有關。

誘導腫瘤細胞凋亡、阻遏周期、抑制遷移是抗瘤藥物主要的作用機制。研究表明許多植物黃酮(如姜黃素、原花青素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、槲皮素等)可以通過干擾PI3K-Akt信號通路，直接抑制PI3k或阻斷PI3K-Akt信號通路，進一步調節其下游效應分子的表達，從而加速腫瘤細胞周期、促進細胞凋亡和抑制細胞增殖，達到抗腫瘤的作用[15,16]。Xiang等[17]研究表明，槲皮素誘導HeLa細胞凋亡是通過下調PI3K-Akt信號通路中PI3k、Akt和Bcl-2表達，上調Bax表達，使細胞在G0/G1細胞周期阻滯。木犀草素可以通過抑制PI3K-Akt信號通路中MMP-2、MMP-9的表達抑制人黑色素瘤細胞的增殖，誘導其凋亡發揮抗瘤活性[18]。本研究細胞水平的實驗結果表明，雪菊總黃酮明顯抑制了A549細胞的增殖，促進了細胞的凋亡，抑制細胞的遷移，mRNA水平上驗證了雪菊總黃酮上調Bax的表達及下調Bcl-2和MMP-2的表達。當細胞內Bax高表達時，細胞對死亡信號敏感，促進了細胞發生凋亡。當Bcl-2高表達時，Bcl-2可以和Bax形成異源二聚體，抑制細胞凋亡。所以細胞內Bax/Bcl-2的比例對決定細胞凋亡的敏感性起到重要作用，因此利用Western blot在細胞水平上的驗證實驗表明雪菊總黃酮明顯上調Bax/Bcl-2的比值，促進了A549細胞的凋亡。結合網絡藥理學分析的結果，雪菊總黃酮可通過多靶點、多途徑實現干預NSCLC的作用，其抗腫瘤活性可能與影響凋亡基因Bax及Bcl-2的表達有關。

本文在細胞水平觀察到了雪菊總黃酮提取物對A549細胞的抗瘤作用，但由于大孔樹脂純化總黃酮的得率較低，藥物對細胞抑制率的IC50較高，后續為進行體內的動物實驗，將優化純化方法，提高黃酮得率，降低藥物使用濃度，結合網絡藥理學分析結果，進一步深入研究其抗瘤的分子作用機制。