UPLC-Q-TOF-MS/MS結合網(wǎng)絡藥理學和分子對接探討橢圓葉花錨抗肝炎的藥效物質及作用機制

左文明，李錦萍，李彩明，王虹雨，劉力寬*，曾 陽,2*

1青海師范大學生命科學學院 青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海 西寧810008；2高原科學與可持續(xù)發(fā)展研究院，西寧 810008

橢圓葉花錨(HaleniaellipticaD.Don)為龍膽科(Gentianaceae)花錨屬(Halenia)植物，性味苦寒，全草入藥，藏醫(yī)藥系統(tǒng)常用于治療肝膽系統(tǒng)疾病[1]。臨床用于治療肝炎等“協(xié)日”和“熱”過剩所致疾病。橢圓葉花錨雖然在臨床已得到使用，并且橢圓葉花錨對治療肝炎、實驗性肝損傷確有療效已被證實[2]。但關于其抗肝炎的文獻報道卻不多，作用機制更尚不清楚，因此需要進一步研究，明確其作用機制，為藏藥的發(fā)展及利用提供理論依據(jù)。

網(wǎng)絡藥理學是一門新興的藥理學分支學科，以系統(tǒng)生物學和網(wǎng)絡生物學基本理論為基礎，通過利用相關數(shù)據(jù)庫和算法進行深度挖掘、分析和整理匯總，從而構建藥物作用于疾病的靶點及機制網(wǎng)絡，具有整體性、系統(tǒng)性的特點，因此，特別適合于中藏藥這種組分多、作用靶點多及作用途徑復雜的藥物作用機制研究[3-5]。本研究擬利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，通過網(wǎng)絡藥理學的研究方法，探究橢圓葉花錨抗肝炎的潛在作用機制，并篩選出其活性成分及其作用靶點，以期為橢圓葉花錨抗肝炎藥理作用機制的進一步研究提供新的思路和理論基礎。

1 儀器與材料

Xevo G2-XS QTof液質聯(lián)用儀(美國Waters公司)；ACQUITY UPLC HSS T3(100×2.1 mm,1.8 μm)色譜柱(美國Waters公司)；Secura513-1CN精密天平(德國賽利多斯)；KQ3200DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山舒美超聲儀器有限公司)；N1200BV-W小型濃縮系統(tǒng)(日本東京理化器械株式會社)；Eyela CA-1115B冷卻水循環(huán)裝置(日本東京理化器械株式會社)；Eyela FDU-2110冷凍干燥機(日本東京理化器械株式會社)；Milli-Q超純水儀(美國密理博)，5810R臺式高速冷凍離心機(德國艾本德)。

甲醇、乙腈、甲酸為質譜級(美國Fisher公司)；氫氧化鈉(ACS級)(美國Sigma公司)；亮氨酸腦啡肽(StandardsKit for TOF G2-S)(美國Waters公司)；蒸餾水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)；超純水(Milli-Q超純水儀制備)；其它試劑均為分析純。

2 方法

2.1 橢圓葉花錨化學成分分析

橢圓葉花錨樣品采集于青海地區(qū)，由青海師范大學曾陽教授鑒定為橢圓葉花錨(HaleniaellipticaD.Don)。取樣品20 g，粉碎，過80目篩，得樣品粉末。精密稱取粉末0.5 g，置50 mL錐形瓶，加入7.5 mL甲醇浸沒，50 ℃水浴，超聲提取1 h，取粗提液100 μL于1.5 mL離心管內，加入75%乙腈500 μL稀釋，混勻靜置2 min，冷凍離心15 min(12 000 rpm，10 ℃)。取上清液過0.2 μm微孔濾膜至進樣瓶，4 ℃保存，備用。

色譜條件：Waters ACQUITY UPLC HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)，體積流量0.3 mL/min,進樣量1 μL，柱溫40 ℃；流動相0.1%甲酸水溶液(A)-0.01%甲酸乙腈溶液(B)；梯度洗脫條件：0～1 min，99%→90%A；1～10 min，90%→74%A；10～14 min，74%→34%A；14～16 min，34%→1%A；16～19 min，1%A；19～20 min，1%→99%A；20～23 min，99%A。

質譜條件：電噴霧離子源正/負離子模式(ESI+/ESI-)，Continuum模式采集MSE數(shù)據(jù)：校正液為200 pg/μL亮氨酸腦啡肽(leucine-enkephalin)，0.5 mM甲酸鈉(sodium-formate)。掃描范圍m/z50～1 200，掃描時間0.2 s，檢測時間20 min。低能量碰撞電壓(CE)6 V，高能量碰撞電壓為20～60 V；正/負離子模式毛細管電壓均為2 kV，錐孔電壓為45 V，離子源溫度為100 °C，輔助噴霧電離與去溶劑氣體為高純度N2，去溶劑化溫度350 °C，錐孔氣體流量50 L/h，去溶劑化氣體流量600 L/h。

利用UNIFI數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Masslynx V4.1軟件及文獻比對，完成色譜峰對應化合物的定性分析，篩選確定橢圓葉花錨的化學成分。

2.2 橢圓葉花錨作用靶點預測

通過Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)對鑒定的化合物檢索查詢Canonical SMILES號，未檢索到的化合物利用ChemDraw將化合物結構式保存為SDF格式，將SDF格式文件導入OpenBabel獲得Canonical SMILES號；將獲得的Canonical SMILES號上傳Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫(http://swisstargetprediction.ch/)，點擊Predict targets進行預測分析，輸出化合物靶點信息[6]。將獲得的化合物靶點信息導入Uniport數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，物種選擇“Homo Sapiens”，進行標準化，下載結果。以關鍵詞“hepatitis”在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(https://www.disgenet.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)中檢索疾病相關靶點。將橢圓葉花錨活性成分的靶點信息與肝炎疾病相關的靶點信息構建韋恩圖，得到橢圓葉花錨治療肝炎疾病的潛在靶點。

2.3 構建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(PPI)

將“2.2”獲取的潛在靶點導入String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)，選擇“Multiple protein”，物種選擇“Homo Sapiens”，下載蛋白相互作用結果，導入Cytoscape 3.6.0軟件，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡圖。

2.4 GO功能與模塊分析、KEGG 富集通路分析

將篩選出的橢圓葉花錨治療肝炎的潛在靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)進行基因本體(Gene Ontology，GO)生物學過程分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，以P<0.05為篩選條件，得到相關分析結果。

2.5 橢圓葉花錨化學成分-靶點-通路網(wǎng)絡構建

利用Cytoscape 3.6.0軟件構建橢圓葉花錨化學成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖。其中，節(jié)點代表化學成分、靶點和信號通路，邊用來連接化學成分、靶點和信號通路。

2.6 主要活性成分-靶點分子對接驗證

對篩選的橢圓葉花錨主要活性成分及核心靶點進行分子對接驗證，并用治療乙型肝炎藥物Entecavir做對照分析。首先通過Chem 3D 19.0對主要活性成分化學結構進行優(yōu)化，然后用AutoDock 4.2.6確定配體可旋轉鍵等，之后從PDB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/pdb)獲得關鍵靶點的3D結構，運用PyMOL 2.3.4軟件對蛋白質進行去水、去配體等操作，使用 AutoDock 4.2.6軟件對關鍵靶點進行加氫和計算電荷等處理，最后利用AutoDock Vina 1.1.2軟件進行對接，并用PyMOL 2.3.4軟件對結果進行可視化處理。

3 結果

3.1 橢圓葉花錨主要化學成分

通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析得到橢圓葉花錨總離子流圖(見圖1)。利用UNIFI數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)、Masslynx V4.1軟件及文獻比對，完成色譜峰對應化合物的定性分析，得到40個化合物，主要包括獐牙菜苷、車葉草苷酸、馬錢苷酸、β-天麻素、京尼平苷酸及口山酮類等(見表1)。

圖1 橢圓葉花錨樣品TIC圖Fig.1 TIC diagram of positive and negative ion patterns of Halenia elliptica D.Don

表1 橢圓葉花錨中主要化學成分Table 1 Identification of chemical constituents in Halenia elliptica D.Don

續(xù)表1(Continued Tab.1)

3.2 活性成分靶點預測

按照方法“2.2”，利用Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫對40個化合物進行靶標預測，其中ascorbylglucoside化合物靶點預測結果中probability>0的結果為0個。將審核過的462個靶點與604個DisGeNET數(shù)據(jù)庫檢索與肝炎相關的靶點和9 631個GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索相關靶點，構建韋恩圖(圖2)，得到33個橢圓葉花錨治療肝炎的潛在作用靶點，靶點信息見表2。

表2 橢圓葉花錨抗肝炎潛在靶點Table 2 Potential target of anti-hepatitis in the Halenia elliptica D.Don

圖2 橢圓葉花錨抗肝炎靶點韋恩圖Fig.2 Venn diagram of anti-hepatitis target of Halenia elliptica D.Don

3.3 蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡構建

按照方法“2.3”，得到蛋白相互作用網(wǎng)絡圖，如圖3所示，節(jié)點表示靶點，邊表示靶點間關聯(lián)，靶點大小和顏色與degree值成正相關。該網(wǎng)絡共有33個靶點、348條邊，平均節(jié)點度21.1。其中具有較大度值(degree值>25)的蛋白質有VEGFA、TNF、IL6、MAPK1、CASP3、STAT3、PTGS2、MAPK8、JUN等。通過網(wǎng)絡圖，能直觀看出靶點之間復雜的互作關系，進一步表征了橢圓葉花錨通過多成分、多靶點協(xié)同調控治療肝炎的作用特點。

圖3 靶點間相互作用網(wǎng)絡Fig.3 Interaction network among targets

3.4 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將“2.2”篩選出的橢圓葉花錨治療肝炎的潛在靶點輸入DAVID數(shù)據(jù)庫進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。從生物過程(biologicalprocess，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)3個水平對33個靶點進行GO功能富集分析，按照P<0.05的閾值過濾，3個水平分別得到28、16、4條生物功能。按照富集的顯著程度取排名靠前的條目繪制可視化條形圖，見圖4。KEGG通路富集分析，按照P<0.05的閾值過濾，得到53條通路，選取排名靠前的通路繪制氣泡圖，見圖5。

圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

GO 分析顯示，在生物學過程方面，主要包括白細胞遷移(leukocyte migration)、一氧化氮生物合成過程的正調控(positive regulation of nitric oxide biosynthetic process)、血小板活化(platelet activation)、細胞外調節(jié)蛋白酶ERK1和ERK2級聯(lián)的正調控(positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade)、平滑肌細胞增殖的正調控(positive regulation of smooth muscle cell proliferation)、細胞對糖皮質激素的反應(response to glucocorticoid)、FcεRI受體信號通路(Fc-epsilon receptor signaling pathway)、磷脂酰肌醇3-激酶信號轉導的調控(regulation of phosphatidylinositol 3-kinase signaling)、白細胞與細胞的粘附(leukocyte cell-cell adhesion)、蛋白質磷酸化(protein phosphorylation)、肽絲氨酸磷酸化(peptidyl-serine phosphorylation)、細胞形狀的調節(jié)(regulation of cell shape)、肽基蘇氨酸磷酸化(peptidyl-threonine phosphorylation)、磷脂酰肌醇-3-磷酸酯的生物合成過程、(phosphatidylinositol-3-phosphate biosynthetic process)等生物過程。細胞組分方面，靶點涉及膜(membrane)、質膜的外側(external side of plasma membrane)、膜筏(membrane raft)、細胞表面(cell surface)、質膜的組成部分(integral component of plasma membrane)等組分。分子生物學功能方面涉及DNA結合(DNA binding)、轉錄因子結合(transcription factor binding)、轉錄因子活性，序列特異性DNA結合(transcription factor activity,sequence-specific DNA binding)、ATP結合(ATP binding)、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、激酶活性(kinase activity)、轉錄調控區(qū)DNA結合(transcription regulatory region DNA binding)、染色質結合(chromatin binding)、RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)域序列特異性DNA結合(RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific DNA binding)、轉錄激活子活性，RNA聚合酶II核心啟動子近端區(qū)域序列特異性結合(transcriptional activator activity,RNA polymerase II core promoter proximal region sequence-specific binding)等分子生物功能。

KEGG 通路富集結果(圖5)顯示橢圓葉花錨抗肝炎的靶點主要涉及TNF信號通路(14個靶點，42%)、乙型肝炎(11個靶點，33%)、Toll樣受體信號通路(9個靶點，27%)、甲型流感(10個靶點，30%)、T細胞受體信號通路(8個靶點，24%)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)(9個靶點，27%)、胰島素抵抗(8個靶點，24%)、神經(jīng)營養(yǎng)蛋白信號通路(8個靶點，24%)、EB病毒感染(8個靶點，24%)、HTLV-I感染(10個靶點，30%)、破骨細胞分化(8個靶點，24%)、丙型肝炎(8個靶點，24%)、FoxO信號通路(8個靶點，24%)等信號通路。

圖5 KEGG通路富集分析Fig.5 KEGG pathway enrichment analysis

3.5 橢圓葉花錨主要成分-靶點-通路網(wǎng)絡構建

按照“2.5”項中方法構建橢圓葉花錨主要成分-靶點-通路網(wǎng)絡，其中“菱形”表示化學成分，“圓形”表示抗肝炎作用靶點，“V形”表示通路，由圖6可知該網(wǎng)絡由92個節(jié)點，包括種39種成分、33個靶點、20條通路和307條邊，其中化學成分J24、J34、J35、J39、J38、J17、J36、J27、J25、J40等節(jié)點較大，表明與其相連的節(jié)點較多，可能是橢圓葉花錨治療肝炎疾病的重要活性成分，另外PIK3CA、TNF、PIK3R1、MAPK8、LGALS3、PTGS2、MAPK1、MAPK14、APP、STAT3、IL6等靶點節(jié)點較大，可能是橢圓葉花錨治療肝炎疾病的重要作用靶點，其中TNF、Toll-like receptor、FoxO、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等通路可能是橢圓葉花錨治療肝炎疾病的重要通路。

圖6 成分-靶點-通路圖Fig.6 Compound-target-pathway network

3.6 主要活性成分-靶點分子對接驗證

主要活性成分與關鍵靶點的分子對接結果結合能見表3。一般認為，對接能量值小于-4.25 kcal/mol表示兩者間有一定的結合活性，小于-5.0 kcal/mol表示有較好的結合活性，小于-7.0 kcal/mol表示有強烈的結合活性[7]。化合物與靶點對接結果在PyMOL軟件中進行可視化處理(見圖7)。分子對接結果顯示，網(wǎng)絡藥理學所預測的核心成分與關鍵靶點均可自發(fā)結合，證實了網(wǎng)絡藥理學預測結果的可靠性。

表3 橢圓葉花錨抗肝炎核心成分與關鍵靶點的分子對接結果Table 3 Molecular docking results of core anti-hepatitis components of Halenia elliptica D.Don with key targets

圖7 關鍵化合物與靶點的分子對接示意圖Fig.7 Molecular docking diagram of key compounds and core targets注：A～H分別為：J24與PIK3CA、J24與TNF、J24與PIK3R1、J24與MAPK8、J24與LGALS3、J35與PIK3CA、J35與PIK3R1、J35與LGALS3。Note:A～H are as follows:J24 and PIK3CA,J24 and TNF,J24 and PIK3R1,J24 and MAPK8,J24 and LGALS3,J35 and PIK3CA,J35 and PIK3R1,J35 and LGALS3.

4 討論

本研究通過UPLC-Q-TOF-MS/MS技術分析了橢圓葉花錨40種化學成分，主要為以口山酮及其苷為主的黃酮類、裂環(huán)烯醚萜、三萜和生物堿類成分。其中J34、J39、J35、J24、J38等度值較大，且度值排名前十化合物中4個為口山酮類成分，表明口山酮類成分可能是橢圓葉花錨抗肝炎的主要活性成分，且Zhang等[8]研究表明花錨及其所含的口山酮苷為抗肝炎主要成分，是通過增加蛋白質的合成和肝細胞內的糖元和核糖核酸，促進肝細胞合成來實現(xiàn)保肝作用。Wang等[9]探究了2種口山酮單體對肝癌細胞HepG2的增殖抑制作用及其具體機制，發(fā)現(xiàn)2種口山酮化合物均能有效抑制肝癌細胞HepG2的增殖，其機制可能是通過誘導細胞自噬實現(xiàn)。Zhang等[10]研究了山奈酚(kaempfer1)對乙酰氨基酚誘導的急性肝損傷的作用，發(fā)現(xiàn)山奈酚通過抑制JNK通路來保護肝細胞啟動壞死模式，啟動線粒體功能，且山奈酚能上調肝細胞中的GSH，從而達到保肝作用。Shakya等[11]研究發(fā)現(xiàn)山奈酚通過抑制過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉移酶等抗氧化酶的表達，從而降低由酒精和多不飽和脂肪酸引起的小鼠肝組織的氧化應激反應，進而對由此引發(fā)的肝損傷起到一定的保護作用。其余幾種度值較大的重要成分文獻報道較少，其藥效學及作用機制需進一步實驗證明。

由KEGG通路富集及成分-靶點-通路網(wǎng)絡圖可知，PIK3CA、TNF、PIK3R1、MAPK8、LGALS3、MAPK1、MAPK14、STAT3、IL6、PTGS2等靶點和TNF、Toll-like receptor、FoxO 、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等信號通路degree值較大，與其相連的成分較多，可能是橢圓葉花錨抗肝炎的主要潛在靶點與通路。

PI3K信號通路是細胞內控制細胞的增殖、凋亡和代謝的關鍵性信號轉導通路[12-14]，且PIK3CA和PIK3R1在肝癌、腦癌、乳腺癌、胃癌和結腸癌里突變率較高[15,16]。Griffith等[17]通過研究人類乳腺癌中PIK3CA和PIK3R1基因表達情況，從而創(chuàng)建了PIK3CA和PIK3R1影響突變的腫瘤基因型譜，為基因治療癌癥開辟了新途徑。Xiao等[18]研究發(fā)現(xiàn)亞低溫預處理能夠通過PI3K/AKT/FOXO3a通路抑制炎癥細胞因子的釋放和凋亡，對缺血再灌注肝損傷具有保護作用。Jiang等[19]研究發(fā)現(xiàn)表沒食子兒茶素沒食子酸酯能顯著改善膽道梗阻大鼠肝損傷及病理形態(tài)，其作用機制可能是通過調控PI3K/Akt信號通路，促進PI3K、AKT的磷酸化，抑制肝細胞的凋亡來實現(xiàn)的。PIK3CA和PIK3R1均屬于PI3K信號通路，PI3K/Akt通路可通過激活肝星狀細胞和成纖維細胞促進肝纖維化[20]，橢圓葉花錨中口山酮類成分可能是通過介導PI3K信號通路，抑制肝細胞凋亡來實現(xiàn)抗肝炎的作用。

MAPKs是眾多信號蛋白的一種，其激活調控一系列細胞活動。活化的絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通過磷酸化核轉錄因子、細胞骨架蛋白及酶類等參與細胞增殖、分化、轉化及凋亡的調節(jié)，并與炎癥、腫瘤等多種疾病的發(fā)生密切相關[21]。Roman等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在RAW264.7巨噬細胞中，sPGN強度將會激活MAPK1/ERK2通路，中度激活MAPK8/JNK通路，輕度激活P38通路，其中ERK通路主要介導炎癥反應，P38通路在炎癥條件下的激活具有多種特性[23]。其中MAPK8基因在肝癌，胃癌，胰腺癌等人體的多個部位的腫瘤組織中均呈現(xiàn)高表達，致癌機制均是MAPK8通路先被外界刺激因素激活，轉至細胞核內提高轉錄因子的活性，進一步使癌細胞增殖和分化[24,25]。

TNF作為一種重要的細胞因子，可誘導細胞內多種信號通路，包括增殖、凋亡、炎癥、免疫等。Wang等[26]研究發(fā)現(xiàn)，慢性丙型肝炎患者TNF水平較正常健康人明顯偏高。Tilg等[27]研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎患者血清致炎因子TNF-α、IL-6水平的高低能夠反映肝細胞損害的程度。TNF-α、IL-6作為重要的致炎因子，對乙肝的發(fā)生、發(fā)展起到了重要的作用，且與疾病的嚴重程度呈正相關，因此，目前研究認為中醫(yī)藥可以通過降低血清中TNF-α、IL-6水平而起到保肝作用[27]。

綜上，本研究在橢圓葉花錨化學成分的測定分析基礎上，利用網(wǎng)絡藥理學的分析方法，分析了橢圓葉花錨40種化學成分33個抗肝炎的潛在作用靶點，發(fā)現(xiàn)橢圓葉花錨可能通過白細胞遷移、一氧化氮生物合成過程的正調控、血小板活化、細胞外調節(jié)蛋白酶ERK1和ERK2級聯(lián)的正調控、磷脂酰肌醇3-激酶信號轉導的調控等生物過程，以及TNF、PI3K、Toll-like receptor、FoxO、HIF-1、VEGF、Fc epsilon RI等關鍵信號通路，發(fā)揮抗肝炎的作用。分子對接結果驗證了預測的主要化學成分和關鍵靶點有較好結合活性，表明本研究的預測較為準確可靠，當然，本研究也具有一定局限性，如數(shù)據(jù)庫不完善等，因此后續(xù)還需對相關靶點通路進行驗證。