一株海洋源長枝木霉菌ST-27的發酵產物對無乳鏈球菌的抑制作用研究

蘇艷君，鄭詩婷，吳 鵬，唐 旭*

1廈門醫學院附屬口腔醫院，廈門 361006；2自然資源部第三海洋研究所 海洋生物資源開發利用工程技術創新中心，廈門 361005

無乳鏈球菌(Streptococcusagalactiae)也稱B族鏈球菌，是能引起人和動物很多疾病的病原菌，在健康成年人的下消化道和泌尿生殖道大約有15%～30%的定殖率，當人體免疫低下或缺陷時易發生無乳鏈球菌感染從而引發尿路感染、皮膚軟組織等感染，導致孕婦發生早產、胎膜早破、死胎等各種不良妊娠結局及新生兒敗血癥和腦膜炎等嚴重的新生兒感染疾病[1-3]。2010年美國疾病控制與預防中心(CDC)推薦青霉素作為非青霉素過敏孕婦及新生兒無乳鏈球菌感染的首選治療用藥，青霉素過敏的人群使用大環內酯類抗生素紅霉素和(或)林可酰胺類抗生素克林霉素[4]。Zhou等[5]分析了不同類型無乳鏈球菌感染新生兒的臨床特點及其對藥物的敏感情況，早發型無乳鏈球菌感染與晚發型無乳鏈球菌感染具有不同的臨床特點，建議臨床應根據無乳鏈球菌藥敏結果合理選用敏感率較高的抗菌藥物(青霉素、萬古霉素、氨芐西林和美羅培南)治療，避免使用耐藥率較高的藥物。Liu等[6]針對圍產期婦女產前無乳鏈球菌感染情況及藥物敏感性開展研究，發現無乳鏈球菌在圍產期婦女陰道分泌物檢出率達4.74%，β-內酰胺類無耐藥，但青霉素敏感度有下降表現。綜上所述，目前臨床上對無乳鏈球菌病的防治主要采用抗生素治療手段，然而隨著抗生素的大量使用，使無乳鏈球菌的耐藥性增強[7]，例如克林霉素與紅霉素以前曾作為治療無乳鏈球菌的二線藥物，現國內外均有研究報道其耐藥率逐年上升[8,9]，并且國內耐藥率一直顯著高于國外[10,11]。因此，使用生物手段，利用新型生物活性物質以應對病原菌及其耐藥性的增強成為當前醫藥界的迫切需要。Lu等[12]以微生態防控的角度尋找水生動物無乳鏈球菌病的防治方法，他們以21株芽孢桿菌Baciclus作為來源菌株，篩選出一株對無乳鏈球菌有較強抑制作用的菌株BA015，發現該菌株及其去菌體發酵液對無乳鏈球菌病的防治存在潛在應用價值。

木霉屬真菌廣泛分布于世界各地，種類十分豐富。木霉菌及其代謝產物對多種病原菌有很強的抑制作用，與化學抗生素相比，具有天然、無毒、無污染的特點，因此以木霉及其代謝產物為基礎的生物抗生素成為研究熱點。截止目前，從木霉菌中分離得到有抑菌效果的代謝物有140余種，例如木霉素、綠粘帚霉素、綠膠霉素等[13,14]。海洋來源微生物已經成為分離新的活性代謝產物的重要資源，尤其是海洋來源真菌具有產次級代謝產物巨大潛能，其次級代謝產物大多具有較好的生物活性，包括抗菌、抗腫瘤活性等[15]。相比陸地環境中被分離和鑒定的真菌，海洋環境中的真菌很少被分離和鑒定[16,17]。海洋作為一個復雜多變的生態系統，具有不同于陸地的高壓、高鹽、低溫、寡營養等特殊性，這些因素使海洋微生物易產生不同于陸源生物且具有特殊功能的活性物質。因此，從海洋源微生物中尋找具有功效特異、結構新穎的生物活性物質的概率更大，是研究開發新型生物活性物質的重要資源[18]。木霉菌是一種重要的生防菌，近年來國內外對其展開了大量的研究。本文自海洋底棲動物海綿中篩選獲得一株抗革蘭氏陽性菌的長枝木霉ST-27，對其發酵產物抗無乳鏈球菌的性能進行了初步研究，為新型生物抑菌劑的開發提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

本文所用長枝木霉菌ST-27由自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發利用工程技術創新中心實驗室分離自海綿并保藏；無乳鏈球菌標準菌株ATCC12386和CMCC(B)32116購自廣東省微生物菌種保藏中心。

長枝木霉ST-27的培養基配方：PDB液態培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、H2O 1 000 mL，pH 5.2±0.2；PDA固態培養基：24 g PDB培養基、瓊脂糖12 g、H2O 1 000 mL，pH 5.2±0.2；FS1培養基：大米100 g、玉米面0.15 g、大豆蛋白胨0.45 g、海鹽1.5 g、H2O 120 mL，詳細配制方法為：玉米面、蛋白胨先用1.5%海鹽水加熱溶解，然后和大米一起用電飯煲蒸約40 min，分裝到1 L錐形瓶中，每瓶200 g(相當于100 g大米原料)，121 ℃，高壓滅菌20 min。

無乳鏈球菌的培養基為TSB培養基：胰蛋白胨17 g，大豆蛋白胨3 g，NaCl 5 g，葡萄糖2.5 g，KH2PO42.5 g，H2O 1 000 mL。

1.2 長枝木霉ST-27的發酵及其二氯甲烷萃取物的制備

本實驗方法參考文獻[19]并做了適當的修改：將長枝木霉ST-27接種于PDA平板上28 ℃恒溫培養2～3天后，作為固態培養種子用打孔器打成每個Φ6 mm的小圓餅加入含50 mL PDB培養基的250 mL錐形瓶中，28 ℃、180 rpm的搖床里培養2天，用作液體培養種子。每個含200 mL FS1培養基的1 L錐形瓶中接入10 mL種子液，在28 ℃條件下培養30～42天。固態發酵結束后使用甲醇萃取，甲醇萃取液在45 ℃水浴條件下旋蒸濃縮，濃縮液經二氯甲烷超聲萃取，得溶劑萃取物。

1.3 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌的抑制效果

本實驗方法參考文獻[20]并做了適當的修改：取“1.2”中制備所得長枝木霉ST-27發酵液的二氯甲烷萃取物用甲醇溶解成50 mg/mL母液備用，使用甲醇對配置好的母液進行二倍法稀釋得到25、12.5…0.195 3 mg/mL稀釋液備用。將無乳鏈球菌接種于TSB液態培養基中培養10 h，使用培養基細菌濃度調節為3.42×108CFU/mL，后用TSB培養基稀釋1 000倍備用。試驗組中在96孔板的每孔分別加入180 μL稀釋菌液，20 μL不同濃度的ST-27二氯甲烷萃取物或甲醇溶液，即二氯甲烷萃取物終濃度為5、2.5、1.25 …0.019 53、0 mg/mL；設置陽性對照組，每孔加入180 μL稀釋菌液和20 μL甲醇；設置陰性對照組，每孔加入200 μL滅菌TSB液態培養基；設置正常生長對照組，每孔加入180 μL稀釋菌液和20 μL滅菌TSB液態培養基；各組設三組平行試驗，測定起始OD600值，于37 ℃恒溫培養箱靜置培養20 h后測定培養后OD600。抑菌率計算方式如下：

1.4 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌生物被膜的影響

取“1.2”中制備所得長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物用甲醇溶解成200 mg/mL母液備用，使用甲醇對配置好的母液進行二倍法稀釋得到100、50…0.195 3 mg/mL稀釋液備用。將無乳鏈球菌接種于TSB液態培養基中培養10 h，使用培養基細菌濃度調節為3.42×108CFU/mL，后用TSB培養基稀釋1 000倍備用。試驗組中向96孔板的每孔中加入180 μL稀釋菌液，20 μL不同濃度的ST-27二氯甲烷萃取物或甲醇溶液，即二氯甲烷萃取物終濃度為5、2.5…0.019 53 mg/mL，于30 ℃恒溫培養72 h。取出96孔板，小心倒掉菌液(以免造成生物被膜脫落)，無菌水清洗兩遍，倒置晾干，每孔加50 μL的1%的結晶紫染色15 min。無菌水清洗，倒置晾干。每孔加200 μL 95%乙醇溶液溶解結晶紫，酶標儀測定OD620值。

1.5 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌細胞形態的影響

取OD600值為1的無乳鏈球菌，稀釋1 000倍后加入長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物至最終菌液中樣品濃度為2 MIC，設空白對照組，于37 ℃、180 rpm搖床中培養10 h后經3 000 rpm離心1 min，得到的菌液再經生理鹽水淸洗兩遍，離心收集菌體，用3%戊二醛固定2 h后涂片，磷酸鹽緩沖液洗滌3次，依次以30%、50%、75%、95%乙醇順序脫水各1次，每次10 min，然后以無水乙醇重復脫水3次，每次5 min，使用50%、70%、90%、100%乙酸異戊酯逐級置換乙醇，每級置換2 min，將樣品放入Hep-2臨界干燥器內，加液態二氧化碳作介質進行干燥，干燥后的標本放入高真空蒸發器中，噴金鍍膜，經掃描電子顯微鏡下觀察，拍照。

1.6 常見抗菌藥物對無乳鏈球菌的抑菌效果比較

用臨床上常用的抗生素青霉素(penicillin，PC)、四環素(tetracycline，TC)、鏈霉素(streptomycin，SM)、利福平(rifampicin，RFP)、紅霉素(erythromycin，EM)、氨芐青霉素(ampicillin，AMP)、卡那霉素(kanamycin，KAN)、慶大霉素(gentamicin，GEN)，采用藥敏紙片法測定無乳鏈球菌標準菌株對各抗生素的敏感度，與長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物進行活性比較。配制TSB培養基，高溫高壓滅菌20 min，待TSB培養基溫度降至55 ℃左右后以1%比例加入活化好濃度為3.42×108CFU/mL的無乳鏈球菌。混勻后均勻倒板，每個平板12 mL。待培養皿冷卻后，每個培養皿放置一種抗生素，每種抗生素做三個重復。

2 實驗結果

2.1 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌的抑制效果

如表1所示，長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對兩株無乳鏈球菌表現出良好的抑制效果，抑菌圈均接近30 mm，因此本次研究的后期實驗采用無乳鏈球菌標準株ATCC12386。

表1 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對不同株無乳鏈球菌的抑制效果Table 1 Inhibition effect of T.longibrachiatum ST-27 dichloromethane extract on S.agalactiae

由表2可知菌液加培養基和菌液加甲醇無差異，甲醇對無乳鏈球菌無抑制效果。抑菌率為100%的長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物最小濃度為0.312 mg/mL，由此可知，該萃取物對無乳鏈球菌的最低抑菌濃度(MIC)為0.312 mg/mL。由圖1并結合SPSS 20.0 logit回歸模型可知，長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌的半數有效量(IC50)為0.035 mg/mL。

表2 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌的抑制作用Table 2 Inhibition of the dichloromethane extract of ST-27 on S.agalactiae

圖1 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌的抑制效果圖Fig.1 Inhibition effect of ST-27 CH2Cl2 extract against S.agalactiae

2.2 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌生長的影響

由圖2可知，空白對照組與加入1/4 MIC、1/16 MIC長枝木霉ST-27發酵液的二氯甲烷萃取物處理后的無乳鏈球菌生長曲線存在明顯差異性。空白對照組與1/4 MIC組均在4 h時達到穩定期，但1/4 MIC處理后的無乳鏈球菌的穩定期OD600值較空白組低，對數期OD600值增長較空白組平穩。而1/16 MIC組在11 h后達到穩定，對數期延長，穩定期其OD600值與空白組差異不明顯。因此可看出在1/4 MIC濃度下活性產物對無乳鏈球菌可有殺菌作用，在1/16 MIC濃度下活性產物對無乳鏈球菌存在明顯抑制其生長速度的作用。

圖2 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌生長曲線的影響Fig.2 Effects of ST-27 CH2Cl2 extract on growth curve of S.agalactiae

2.3 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌生物被膜的抑制效果

由圖3可知，OD620隨長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物的濃度上升而升高，當濃度為lg(c)=3.4即1.25 mg/mL時最高，隨后急劇下降，由此可知長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌生物被膜形成具有重要的影響。

圖3 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌生物被膜的影響Fig.3 Effects of ST-27 CH2Cl2 extract on the biofilm of S.agalactiae

2.4 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌生物形態的影響

由圖4可知，未經長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物處理的無乳鏈球菌呈表面光滑的球形菌，經樣品處理后的無乳鏈球菌在細胞形態上發生了明顯變化，主要表現為：表面皺縮、粗糙，個別無乳鏈球菌出現破裂現象(見圖4b箭頭所示)。Shan等[21]通過高倍數掃描電鏡觀察由萬古霉素和抗菌肽處理過的無乳鏈球菌的表面形態，結果顯示細胞皺縮和破裂。由此可見活性產物對無乳鏈球菌的細胞形態有一定的作用，可抑制無乳鏈球菌的生物被膜形成。

圖4 無乳鏈球菌的掃描電鏡圖Fig.4 The scanning electron microscopy pictures of S.agalactiae 注：a和b分別為經長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物處理前后的無乳鏈球菌。Note:a and b are the S.agalactiae before and after treatment with ST-27 CH2Cl2 extract.

2.5 長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物與臨床常用抗生素的抑菌活性對比

二氯甲烷萃取物與臨床常用抗生素的抑菌活性的實驗中所用抗生素藥敏紙片規格均為30 μg/片，實驗結果由圖5可知，無乳鏈球菌對四環素最敏感，抑菌圈直徑為36.67 mm；利福平次之，抑菌圈直徑為34.23 mm；鏈霉素對無乳鏈球菌無抑制作用。圖5中數據可看出長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌的抑制活性可達到臨床上無乳鏈球菌敏感的藥物的80%，表現出較強的抑制活性。另一方面，Hu[22]采集了1 000例孕晚期婦女的泌尿生殖道標本進行了無乳鏈球菌培養及藥敏試驗研究，結果顯示孕晚期婦女無乳鏈球菌感染率較高，容易通過母嬰垂直傳播感染新生兒；在實驗室藥敏結果顯示無乳鏈球菌耐藥性較高的三種抗生素依次為四環素(86.44%)、紅霉素(73.73%)、阿奇霉素(56.78%)，應早期選擇合適抗生素治療。Zhang等[23]從353例的門診及住院患者細菌培養分離的無乳鏈球菌進行耐藥性分析，結果顯示耐藥率最高的四環素(91.5%)、對紅霉素、克林霉素、環丙沙星、左旋氧氟沙星耐藥率較高，分別為72.0%～77.1%、61.9%～66.7%、23.7%～28.0%、22.9%～25.6%。

圖5 無乳鏈球菌對長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物與臨床常用抗生素的敏感性對比Fig.5 Comparison of sensitivity of S.agalactiae to ST-27 CH2Cl2 extract and common clinical antibiotics

綜上分析，近年來無乳鏈球菌對常用抗生素的耐藥性不斷提高，因此，長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物與臨床上常用抗生素相比對無乳鏈球菌不但具有較強抑菌活性而且不易產生耐藥性，是開發出新的抑菌活性物質可以有效緩解無乳鏈球菌的耐藥率升高的這一現狀。但考慮到活性物質的濃度更高，且成分復雜，本次實驗結果僅能說明長枝木霉ST-27二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌的抑制作用與臨床上常見的抗生素具有一定的優勢，具備繼續開發研究的潛力。

3 討論

本文初步研究了長枝木霉ST-27發酵產物二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌的抑菌效果。經抑菌實驗檢測出其對三株不同的無乳鏈球菌都表現出了良好的抑制作用，對無乳鏈球菌標準株ATCC12386的MIC值為0.312 mg/mL，表現出良好的抑制活性，與臨床上常用抗生素相比也具有一定的優勢。對無乳鏈球菌的生長曲線影響結果顯示其在低濃度下對無乳鏈球菌有抑制作用，高濃度下有殺菌作用，結合掃描電鏡結果可發現經過處理后的無乳鏈球菌的細胞形態有明顯變化，個別無乳鏈球菌出現破裂現象，可證明該活性物質對無乳鏈球菌的抑制作用之一是作用其生物被膜，為了進一步驗證需要進一步采用透射電鏡觀察其超微結構。無乳鏈球菌在大自然中不僅以浮游的狀態存在，更多情況下也以生物被膜的形式存在，而以生物被膜方式存在的細菌更適應外界環境，有極高的耐藥性，并能夠逃逸宿主的免疫機制[24]。本研究發現，長枝木霉ST-27發酵產物二氯甲烷萃取物對無乳鏈球菌生物被膜的形成具有重要的影響，基于此本研究對無乳鏈球菌的防治提供了新的思路。與此同時，長枝木霉ST-27發酵產物的二氯甲烷萃取物的成分尚未明確，根據相關文獻報道[25]，木霉中分離得到具有抑菌效果的代謝產物主要分為兩大類：小分子類物質，主要有芳香族化合物、聚酮類、丁烯酸內脂類等；大分子類物質如木霉素、膠霉素、抗菌肽等，在未來研究中，我們將對該萃取產物的成分進一步分析，以期得到主要活性物并分析其結構。