緬梔花提取物的揮發性成分鑒定及其葡萄糖轉運機制研究

田 迪，陳 銳，樸永革，付 祺，李 鋒，李河霖，李寶志，桂明英

1云南農業大學茶學院，昆明 650201；2吉林煙草工業有限責任公司技術中心，長春 130031；3云南省高原特色農業產業研究院，昆明 650201

緬梔花(PlumeriarubraL.var.actifoliaBailey)，因其外形極似蛋白包裹蛋黃而又名雞蛋花，屬竹夾科[1]。緬梔花原產于南美洲，在云南較為常見，云南緬梔花具有清熱解毒、利濕、止咳的功效，并且可用來治療傳染性肝炎、支氣管炎、肺結核等疾病。環烯醚萜類及苷類化合物是緬梔花主要的功能性成分，由于其具有很強的抗真菌和抗腫瘤活性作用而受到廣泛關注[2-4]。糖尿病已成為當前威脅全球人類健康最重要的慢性非傳染性疾病之一，并在世界范圍內呈流行趨勢[5]。最新數據統計，中國糖尿病患者人數達到1.139億[6]，并產生巨大的醫療經濟負擔。2型糖尿病病理生理的主要特征是胰島素抵抗和胰島素分泌減少[7]，通常胰島素信號通路的減弱是發生胰島素抵抗的原因[8,9]，PI3K/Akt信號通路是胰島素作用的最主要信號通路。Akt蛋白是PI3K信號通路下游的重要靶蛋白，Akt蛋白是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的一種，各種研究表明Akt在細胞的糖代謝、細胞增殖、凋亡方面占據重要作用[10]。目前對緬梔花的研究主要在其揮發油化學成分檢測及其藥理研究，而緬梔花提取物對骨骼肌細胞Akt調控作用的相關研究鮮有報道[11-14]。有研究表明緬梔花中存在抗糖尿病類異戊二烯和長鏈δ-內酯對α-葡萄糖苷酶有抑制的活性，莖皮提取物黃酮苷可明顯降低四氧嘧啶所致的高血糖大鼠中血清甘油三酯含量，說明緬梔花具有一定的降糖降脂潛力[15,16]。

本研究以緬梔花為實驗材料，通過制備緬梔花水提物，探索其是否可以正向調節某一個關鍵因子如PI3K、Akt/PKB、AS160的磷酸化水平，使其處于活性狀態，進而強化GLUT4的轉移，以期達到降血糖的效果。旨在為云南地區緬梔花資源促進骨骼肌葡萄糖轉運提供理論依據和挖掘其綜合藥用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 緬梔花

實驗用干燥緬梔花材料產自云南省昆明市。

1.1.2 骨骼肌細胞系

C2C12骨骼肌細胞購于ATCC-American type culture collection。

1.1.3 主要實驗試劑

胰島素(江蘇萬邦，7353789)；青鏈霉素混合液(Solarbio)；胰蛋白消化酶(碧云天)；DMSO(Solarbio，67-68-5)；磷酸鹽緩沖液(Solarbio)；DMEM/HIGHGLUCOSE(Hyclone)；抗體(Cell Signaling Technology)；2-NBDG葡萄糖攝取試劑盒(abcam，ab235976)；甲醇(天津致遠，67-56-1)；Meilunbio?飛克特超敏ECL發光液(美侖生物，MA0186)；石油醚(阿拉丁)；乙腈(美國，TEDIA，色譜純)；三氟乙酸(德國，MERCK，色譜純)。

1.2 試驗方法

1.2.1 緬梔花提取物的制備

打碎：使用破壁粉碎機將干燥緬梔花進行破碎化處理；浸出：按料液比1∶20加入熱水，溫度保持在75±10 ℃，浸出0.5 h后，使用三層醫用紗布進行過濾，濾渣保留，按照1∶20、1∶20、1∶10的料液比反復熱水浸出3次，之后將全部濾液合并后做離心處理，取上清液；濃縮：減壓濃縮至原液體積的1/8～1/10后，進入-20 ℃冰箱做冷凍處理；干燥：利用真空冷凍干燥機對冷凍濃縮液進行冷凍干燥處理，得到干燥緬梔花水提取物，含水率低于3 %，產率為10～15 %。

1.2.2 使用氣相色譜-質譜聯用儀(gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS)對緬梔花提取物進行成分測定

儀器：Agilent Technologies-7890A/5975C型氣相色譜-質譜儀；色譜柱：Agilent1909 1S-433UI HP(30 m×0.25mm×0.25 μm)石英毛細管柱；載氣為He，流速為1.2 mL/min，進樣量5 uL，分流比10∶1；程序升溫：起始溫度為60 ℃，然后以6 ℃/min升到280 ℃，保持6 min，再以10 ℃/min升至300 ℃，保持2 min，運行時間為46.667 min；EI電離源，電離能為70 eV，離子源溫度230 ℃；掃描質量范圍m/z：35～550 amu。

1.2.3 細胞培養條件

在細胞培養板中使用含10%牛血清的DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)高糖配方培養液對接種后的C2C12細胞進行培養，至70～80 %細胞出現匯合時換培養液，添加新的培養液前需使用PBS進行1～2次清洗，之后再新加入含有2 %馬血清的DMEM培養液使細胞分化，體外分化培養C2C12細胞4～5天后，進行饑餓處理后加藥，實驗分為空白對照組(0 mg/mL)和不同濃度緬梔花提取物組，濃度分別為1、2、4、8 mg/mL。

1.2.4 免疫印跡試驗(Western blot)檢測

在10 %的SDS-聚丙烯酰胺凝膠分離膠上配制8 %的凝膠，添加經過蛋白定量后的樣本，恒壓電泳1.5 h后，將蛋白轉膜到聚偏二氟乙烯(polyvinylidenefluoride，PVDF)膜上，5%BSA封閉1 h。1∶1 000稀釋一抗抗體，封閉后加入一抗抗體4 ℃搖床8 h，PBST緩沖液洗膜3～4次，每次10 min。之后在封閉液中加入二抗抗體(1∶10 000)辣根過氧化物酶標記的抗鼠抗體，室溫搖床1.5 h。再用PBST洗膜3次，每次10 min。經過化學發光試劑顯色，在曝光機中進行曝光，掃描或拍照后，用圖像處理系統分析目標分子量條帶進行數字化分析處理。

1.2.5 葡萄糖攝取測定(2-NBDG法)

分化后的C2C12細胞設置為空白對照組(control)、緬梔花提取物組(PE)和胰島素陽性對照組(insulin)，使用熒光葡萄糖類似物2-NBDG葡萄糖攝取試劑盒，分別加入2-NBDG低糖培養基后，用熒光酶標儀測定細胞在485 nm激發波長和538 nm發射波長下的熒光強度，對照組2-NBDG攝取率為100%，以2-NBDG為探針計算不同條件下細胞葡萄糖攝取率。

1.2.6 數據分析

采用SPSS統計軟件ANOVA進行顯著性分析，P<0.05視為有顯著性差異，P<0.01視為有極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 緬梔花提取物的主要成分

經GC-MS檢測所得的質譜信息，緬梔花提取物實驗分析結果見圖1，應用譜庫檢索并參考有關文獻[17]，鑒定了緬梔花提取物中含有12個主要成分。

圖1 緬梔花提取物GC-MS實驗結果Fig.1 Results of GC-MS experiment on Plumeria water extract

有研究表明，植物酚酸類、萜類物質具有明顯的降糖作用[18,19]。由表1可知，對緬梔花揮發油中主要化學成分的分離鑒定表明主要成分為31.16%的十六酸(n-hexadecanoic acid)，肉豆蔻酸(tetradecanoic acid)含量為15.02%，9，12-十八碳二烯酸(9,12-octadecadienoic acid)含量為11.01%，還包含其他脂肪酸，酚類，酯類，烷烴類，萜類等成分，說明雞蛋花揮發油中主要成分為脂肪酸和萜類化合物，其中脂肪酸為十六酸、肉豆蔻酸等，占揮發油總量的46%，萜類化合物主要為1，6，10-十二碳三烯-3-醇、2，6，10-十二碳三烯-1-醇和雙十六烷硫醇等，這些成分可能與緬梔花發揮功能性作用相關。從總的結果來分析，主要成分與文獻報道的基本一致[20]，但在相同成分含量上卻存在差異，這可能與雞蛋花產地的土壤性質、地理環境、采摘時間以及測試條件有一定關系。

續表1(Continued Tab.1)

2.2 緬梔花提取物對C2C12細胞生長狀態的影響

由圖2知，不同緬梔花提取物(PE)濃度培養C2C12細胞4 h后，與對照組相比較，不同濃度PE對C2C12細胞增殖情況無明顯影響，未發現促細胞凋亡現象，細胞生長狀態正常。

圖2 緬梔花提取物濃度對C2C12細胞存活率的影響Fig.2 The effect of PE concentration on C2C12 cell vitality

2.3 緬梔花提取物對C2C12細胞中葡萄糖攝取量和對蛋白激酶B(Akt)的調控作用

為了測定不同濃度PE對C2C12細胞中Akt的調控作用，使用PE濃度梯度為1、2、4、8 mg/mL處理之后，以Western blot法檢測Akt磷酸化水平。結果顯示，當PE濃度為1 mg/mL時，對Akt磷酸化的促進效果不明顯，而PE濃度為2 mg/mL時，對C2C12細胞Akt磷酸化促進效果顯著(P<0.05)，當PE濃度為2 mg/mL時，對C2C12細胞Akt磷酸化有極顯著促進效果，當PE濃度為4 mg/mL時，達到最大促進效果(P<0.01)，而在PE濃度增加到8 mg/mL時效果稍有減緩，因此我們選擇將4 mg/mL濃度作為PE正向調控C2C12細胞Akt磷酸化水平的最適劑量(見圖3B)。

在確定最適劑量后，為了確定PE最適處理時間，確定的最適劑量為4 mg/mL濃度的基礎上，選取15、30、45、60 min四個時間梯度進行處理，同樣以Western blot法檢測C2C12細胞中Akt的磷酸化水平。結果表明，當處理時間為15 min時，對Akt磷酸化有一定的促進效果(P<0.05)，處理時間為30 min時，對C2C12細胞Akt磷酸化達到最大促進效果(P<0.01)，而在處理時間為45 min和60 min時，Akt磷酸化的促進效果基本持平，并略有減緩，因此選擇將30 min作為PE正向調控C2C12細胞Akt磷酸化水平的最適處理時間(見圖3C)。

圖3 確定PE對C2C12細胞中Akt磷酸化正向調控作用的最適劑量和時間Fig.3 Determine the optimal dose and time of PE on the positive regulation of p-Akt in C2C12 cells注：與空白對照組相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。下同。Note：Compared with control group,*P<0.5, **P<0.01,***P<0.001.The same below.

有研究表面表明，Akt是胰島素刺激葡萄糖轉運信號通路中的關鍵分子[21]，能增強葡萄糖轉運和代謝，同時腺苷酸激活蛋白激酶(adenosine 5′-monophosphate(AMP)-activated protein kinase，AMPK)和乙酰輔酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)也是與葡萄糖轉運和糖脂代謝密切相關的酶。

在諸多前期研究中，在此胰島素(insulin，1 μL/mL,30 min)作用實驗條件下[22]，骨骼肌的Akt磷酸化水平顯著增高，因此可以作為可靠的陽性對照使用，所以本文選取胰島素(insulin，1 μL/mL,30 min)作為陽性對照，通過PE(4 mg/mL,30 min)處理C2C12細胞，與對照組相比，C2C12細胞再經過PE處理后Akt磷酸化水平顯著增加，同在葡萄糖轉運信號通路下游的Akt底物(A 160 kDa substrate of the Akt Ser/Thr kinase，AS160)的磷酸化水平也明顯增加(見圖4C、4D)。為了考察PE的降糖活性，通過2-NBDG法檢測細胞對葡萄糖的攝取量，如圖4A示，與對照組相比，C2C12細胞再經過PE(4 mg/mL、30 min)處理后對葡萄糖攝取量顯著提高，葡萄糖攝取量提高了1.65倍。

圖4 PE促進C2C12細胞的葡萄糖吸收和刺激Akt、AS160的磷酸化水平Fig.4 PE promotes glucose uptake in C2C12 cells and stimulates the phosphorylation of Akt and AS160

我們又選取和咖啡因(caffeine，1 mg/mL,30 min)作為陽性對照，驗證了PE(4 mg/mL,30 min)對AMPK和ACC的磷酸化水平的影響(見圖5)，通過實驗我們發現PE對AMPK和ACC磷酸化水平沒有影響。

圖5 PE對C2C12細胞P-AMPK和P-ACC的影響Fig.5 The effect of PE on P-AMPK and P-ACC in C2C12 cells

2.4 緬梔花提取物與胰島素的協同作用

胰島素注射是當前糖尿病治療的主要方法，而通過實驗發現PE與胰島素都具有正向調控Akt磷酸水平的作用后，下一步，我們對PE是否有可能與胰島素發生協同作用進行了驗證。實驗結果表明，經PE(4 mg/mL,30 min)和胰島素(insulin，1 μL/mL,30 min)單獨處理后C2C12細胞中Akt磷酸化水平與對照組相比有顯著上升(P<0.01)。PE和胰島素協同作用組(PE，4 mg/mL,30 min+insulin，1 μL/mL,30 min)比PE和胰島素單獨處理組又有了顯著上升(P<0.01)，這個結果說明，PE和胰島素都能夠有效正向調控C2C12細胞Akt的磷酸化水平，同時PE和胰島素還表現出了良好的協同作用效果(見圖6A、6B)。

圖6 PE與胰島素的協同作用Fig.6 The synergistic effect of PE and insulin

3 討論與結論

本實驗通過GC-MS檢測了緬梔花提取物，對緬梔花揮發油中主要化學成分的分離鑒定，檢測出脂肪酸、酯類、烷烴類、萜類等12種主要成分，其中含量較多為十六酸、肉豆蔻酸等。目前已有相關文獻報道，酚類、萜類、烷烴類物質具有明顯的降糖作用，緬梔花中含有這些成分，可能是這些成分對于降糖產生了一定效果。對緬梔花揮發油的成分和組成的研究結果進行報道，為其進一步開發應用打下基礎。

通過實驗，發現在研究中選取的PE濃度范圍，未對C2C12細胞的生長和狀態帶來毒副影響，在各組細胞數量基本一致的情況下，可以排除細胞狀態異常帶來的極端影響，所取得的數據可信度較高。C2C12細胞中的Akt在糖轉運和代謝信號轉導中發揮重要作用，PI3K/Akt/GlUT4途徑被公認為是體內胰島素介導糖攝取的主要信號通路之一[23]。AMPK作為細胞內能量水平的感受器，當細胞內能量水平降低時，AMPK通過磷酸化機制被激活，促進細胞葡萄糖轉運子向細胞膜易位，通過向細胞內轉運葡萄糖來維持細胞能量水平，ACC為AMPK的下游因子。因此，我們也對與葡萄糖轉運信號通路相關的AMPK以及ACC等關鍵酶是否也受到PE的影響進行了進一步的驗證，結果PE處理對C2C12細胞中的AMPK和ACC沒有影響。

PE對C2C12細胞中的Akt具有正向調控作用，與Akt分子有緊密調控關系，這與胰島素依賴性糖轉運信號通路的機動機制相似，因此，我們對PE與胰島素的協同作用也進行了探究。經過實驗驗證了PE與胰島素聯用后，對Akt的刺激作用均強于PE或胰島素單獨作用，顯示了較好協同效應，從正向調控C2C12細胞中Akt活性的角度，明確了PE具有與胰島素類似或者提升胰島素敏感性的作用，提供了緬梔花在醫藥健康領域應用基礎研究依據。

目前，對緬梔花化學成分、功效、加工方法的方面的研究還比較有限，本研究通過緬梔花水提物的成分分析，鑒定分離緬梔花的主要成分及含量，并發現了緬梔花提取物對C2C12細胞Akt磷酸化水平的正向調控作用，明確了緬梔花水提物與胰島素的協同作用，為緬梔花在醫藥和保健品方面的應用提供了一定的理論依據和新的開發思路。