忍冬木層孔菌液體培養物的化學成分研究

張宏岐，鄧改改，汪鋆植，胡 昆，陳瀅潞，李堂麗

1三峽大學醫學院；2天然產物研究與利用湖北省重點實驗室(三峽大學)；3湖北省生物酵素工程技術研究中心(三峽大學)，宜昌 443002

忍冬木層孔菌(Phellinuslonicerinus(Bond.) Bond.et Sing)為木層孔菌屬的一種多孔真菌，其干燥子實體是藥用真菌桑黃的品種之一，也是土家族常用藥材,收載于《湖北省中藥材質量標準》2009年版[1]。桑黃是目前國際公認的抗癌效果最好的藥用真菌之一，作為桑黃使用的裂蹄針層孔菌P.linteus，鮑氏木層孔菌P.baumii等忍冬木層孔菌近緣品種的抗癌活性均有報道[2]。課題組前期對忍冬木層孔菌子實體化學成分[3]、抗腫瘤活性[4,5]、質量控制[6]進行了研究。但由于受氣候條件、地理分布及寄主植物的影響，野生桑黃資源珍稀瀕危，桑黃的人工發酵可以較容易地對各種生長影響因素進行控制和優化，獲得穩定高產的培養物。為獲得桑黃基源菌種培養物替代野生桑黃子實體的潛在價值，探究發酵培養物和子實體之間的共同之處并加以利用，本文對忍冬木層孔菌培養液及其菌絲體中的化學成分進行了研究并對單體化合物的體外抗腫瘤活性進行了測試，以期為桑黃培養物替代子實體來獲得相關的活性化合物提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器

Bruker 400 MHz核磁共振波譜儀(Bruker公司，瑞士)；Finnigin電噴霧質譜儀(Finnigin公司，美國)；Waters1525EF(Waters公司，美國)和Dionex Ultimate 3000高效液相色譜儀(戴安公司，美國)；制備柱為Cosmosil Packed Column 5C-MS-Ⅱ10ID×250 nm；分析柱為Cosmosil Packed Column 5C-MS-Ⅱ4.6ID×250 nm(Nacalai公司，日本)；WZZ-2S數字式自動旋光儀(上海精科實業有限公司)；AL204電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司，瑞士)；U-3010紫外-可見分光光度計(日立儀器(上海)有限公司，日本)；N21001型旋轉蒸發儀(上海愛朗儀器有限公司)等；柱色譜和薄層色譜用硅膠均為青島海洋化工廠產品，其他試劑均為分析純。

1.1.2 菌種及細胞株

實驗用忍冬木層孔菌采自湖北宜昌，經中國科學院微生物研究所卯曉嵐教授鑒定為忍冬木層孔菌(Phellinuslonicerinus(Bond.) Bond.et Sing)，標本及菌種現保存于三峽大學生物與制藥學院天然產物研究利用湖北省重點實驗室。

胃癌細胞株HGC-27、宮頸癌細胞株HeLa、乳腺癌細胞株MCF-7及子宮內膜癌細胞株RL95-2均購買于中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種發酵培養

將菌種從4 ℃冰箱中取出于25 ℃恒溫培養箱中培養1天后轉接至PDA固體平板上，25 ℃恒溫培養7天?；罨蟮木N長滿平板后，用滅菌的打孔器打孔，取菌齡一致的5塊菌塊接種至液體培養基中(250 mL/500 mL三角瓶)，25 ℃、150 rpm恒溫震蕩培養。培養6天后用勻漿機在超凈工作臺中勻漿，作為種子培養液以10%接種量接種至新的液體培養基內，28 ℃、150 rpm恒溫震蕩培養14天。新培養基配方：葡萄糖30 g/L，酵母膏5 g/L，蛋白胨4 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO40.75 g/L，VB10.024 475 μg/L。

1.2.2 提取分離

菌株發酵14天后，發酵液經3～4層紗布過濾后除菌絲體，濾液用等體積乙酸乙酯萃取3次，合并有機相，45 °C真空濃縮后得乙酸乙酯萃取物2.5 g。過濾得到的菌絲體經烘箱45 °C干燥后，用適量95%乙醇冷凝回流提取3次，合并乙醇相，真空濃縮后乙酸乙酯萃取，回收溶劑得乙酸乙酯萃取物1.6 g。

發酵液乙酸乙酯萃取物2.5 g，甲醇溶解后，經200～300目正相硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮(100∶0、90∶10、80∶20、75∶25、70∶30、65∶35、60∶40、55∶45、1∶1)梯度洗脫，甲醇沖柱得10個組分(Fr.1～ Fr.10)，Fr.3(200 mg)經Sephadex LH-20(氯仿：甲醇=1∶1)凝膠色譜，繼而經反相HPLC半制備色譜(30%乙腈-水為流動相)，反復純化得化合物1(22.8 mg)、2(16.3 mg)、3(10.2 mg)、4(5.6 mg)。Fr.4(100 mg)經Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇=1∶1)凝膠色譜，繼而經硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、1∶1)梯度反復純化得化合物8(10.6 mg)、9(7.8 mg)、10(9.6 mg)。

菌絲體提取物乙酸乙酯萃取物1.6 g，丙酮溶解后，經200～300目正相硅膠柱層析分離，以石油醚-丙酮(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、1∶1)梯度洗脫，甲醇沖柱得7個組分(Fr.1～Fr.7)，Fr.3(300 mg)經Sephadex LH-20(氯仿∶甲醇=1∶1)凝膠色譜，繼而經硅膠柱色譜，以石油醚-乙酸乙酯(100∶0、90∶10、80∶20、70∶30、60∶40、1∶1)梯度反復純化得化合物5(30.2 mg)、6(11.6 mg)、7(22.3 mg)。

1.2.3 細胞毒活性篩選

用MTT法檢測10個化合物對HGC-27、HeLa、MCF-7、RL95-2細胞株的細胞毒活性。從母液開始，依次4倍稀釋，共5個梯度，對數生長期的HGC-27、HeLa、MCF-7及RL95-2細胞分別接種于96孔板，每孔100 μL(約1×104個細胞/孔)，6 h后加入不同濃度藥物100 μL，每一濃度3個重復孔，培養24 h后加入MTT 10 μL(質量濃度為5 mg/mL)，繼續培養4 h后棄上清，每孔加入二甲基亞砜100 μL后用酶聯免疫檢測儀測定492 nm處吸光度OD值，計算細胞生長抑制率。細胞生長抑制率=[(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/對照組平均OD值]×100%。以濃度為橫坐標，細胞存活率為縱坐標繪制細胞生長曲線，應用兩點法計算化合物的IC50值。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

圖1 化合物1～10的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-10

化合物8無色晶體(EtOAc)；ESI-MS：m/z137 [M+H]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.52(5H，m，H-2，3，4，5，6)，3.65(2H，s，H-7)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：178.4(C-8)，133.8(C-1)，129.9(C-5)，129.2(C-6)，129.2(C-3)，127.9(C-4)，127.9(C-5)，41.6(C-7)。以上數據與文獻[12]對照基本一致，故確定化合物8為苯乙酸。

化合物9白色結晶(EtOAc)；ESI-MS：m/z267 [2M+Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：9.88(1H，s，CHO)，7.83(2H，d，J= 8.8 Hz，H-2，6)，6.96(2H，d，J= 8.8 Hz，H-3，5)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：191.1(CHO)，167.8(C-4)，132.5(C-2)，132.5(C-6)，130.2(C-1)，115.9(C-5)，115.6(C-3)。以上數據與文獻[13]對照基本一致，故確定化合物9為對羥基苯甲醛。

化合物10無色晶體(EtOAc)；ESI-MS：m/z151[M-H]-；1H NMR(400 MHz，(CD3)2CO)δ：7.52(2H，m，H-2，6)，6.78(2H，s，H-3，5)，3.48(2H，s，H-7)；13C NMR(100 MHz，(CD3)2CO)δ：172.0(C-8)，153.4(C-4)，136.5(C-1)，129.2(C-2)，128.2(C-6)，126.4(C-3)，126.4(C-5)，42.5(C-7)。以上數據與文獻[14]對照基本一致，故確定化合物10為4-羥基苯乙酸。

2.2 體外細胞毒活性篩選

對忍冬木層孔菌液體培養物中分離得到化合物1～10進行了腫瘤細胞HGC-27、HeLa、MCF-7、RL95-2的體外細胞毒活性測試。結果顯示化合物1～4對HGC-27和RL95-2細胞株有不同程度的抑制活性(見表1)，其余化合物濃度為100 μM時對以上四種腫瘤細胞無明顯的細胞毒活性，表中未列出。其中化合物3抑制活性最強，進一步復篩結果顯示，陽性藥順鉑對腫瘤細胞HGC-27、HeLa、MCF-7、RL95-2的IC50分別為15.36、38.36、36.16和1.53 μM；化合物3對HGC-27和RL95-2的IC50分別為6.69、12.81 μM，該化合物對HGC-27的抑制活性優于陽性藥。

表1 化合物1～4對HGC-27、Hela、MCF-7及RL95-2的細胞毒活性Table 1 Cytotoxicity of compounds 1-4 on HGC-27,Hela,MCF-7 and RL95-2 cell

3 結論

本研究從忍冬木層孔菌液體培養物中分離得到10個化合物，除化合物5、6和7外，其余7個化合物均為首次從該種真菌中分離得到?；衔?～7為麥角甾醇類化合物，忍冬木層孔菌子實體中也存在大量的麥角甾醇類化合物[15]，說明桑黃類真菌菌絲體在甾醇類化合物方面具有代替子實體的可能?；衔?～4為環二肽類成分，有研究報道在桑黃類真菌火木層孔菌的發酵液和菌絲體中分離鑒定了14個該類化合物[16]，但在忍冬木層孔菌子實體中只報道過環(亮-纈)二肽成分[15]，提示環二肽類成分同時存在于忍冬木層孔菌子實體及發酵培養物中。同時，體外細胞毒活性顯示化合物1～4對HGC-27和RL95-2細胞株有不同程度的抑制活性，其中化合物3抑制活性最強，對HGC-27和RL95-2細胞株的IC50分別為6.69 μM和12.81 μM。上述研究說明桑黃基源真菌培養物中代謝產物與子實體具有一些共同的化學成分和藥理作用，因此，加大對桑黃基源真菌培養物中有效成分和藥理活性的研究，可為桑黃類真菌活性成分的工業化生產及可持續利用提供一個新的解決途徑。