青陽參根中一個新的苯二氫化萘型木脂素

李小叁，龍 娟，羅宇浩，何妙瑩，吳綺靖，劉 立，楊雪梅

廣東醫科大學藥學院，東莞 523808

青陽參(CynanchumotophyllumSchneid)是蘿藦科鵝絨藤屬植物中常見的民間用藥，該植物多年生草質纏繞藤本，主要分布于我國的云南、四川、廣西、西藏和貴州等省份。青陽參的主要藥用部位為根莖。味辛，甘，性溫，有一定毒性，祛風濕，益腎健脾和胃。現已上市的青陽參片，有平肝補腎、豁痰鎮痙作用，主要用于癲癇、頭昏頭痛、眩暈、耳鳴、腰膝酸軟等癥狀。研究表明，青陽參的干燥根有抗癲癇、抗抑郁、免疫調節、抗肝炎和抗美尼爾綜合征作用[1]。青陽參的化學成分結構類型多樣，主要有C21甾類和去氧寡糖[2]，其中C21甾類被認為是青陽參的特征性物質和主要藥效成分[3-5]。現代藥理學研究表明蘿藦科植物來源的C21甾類成分具有豐富的生物活性，比如抗腫瘤、抗炎、抗真菌、抗病毒等[2]。近些年來，蘿藦科來源的天然C21甾體苷元擁有顯著的抗腫瘤活性[6，7]，具有潛在的研究價值。青陽參是我國的傳統民間用藥，在我國資源豐富，但目前對其化學成分研究多數為C21甾體，缺少對其他類型成分研究。近期本課題組對青陽參干燥根的酸水解物的化學成分進行研究，從中得到了一系列結構新穎、具有顯著抗腫瘤活性的C21甾體苷元[8]。然而在研究過程中，我們發現了其酸水解物中存在一些微量的其他類型成分。因此，為了進一步了解中藥青陽參的物質基礎，提高其資源綜合利用效率，本文對青陽參干燥根的酸水解物的其他類型成分進行了分離純化和結構鑒定，并測試了分離化合物的細胞毒活性，以期發現結構新穎的抗腫瘤先導化合物。

1 材料與方法

1.1 材料

Bruker-AV400 NMR和600 NMR核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；Micromass Q-TOF高分辨(美國Waters公司)和Triple Quad 4500低分辨質譜儀(美國SCIEX公司)；Technologies 1260 infinity系列分析型和制備型高效液相色譜儀(德國Agilent公司)；C18色譜柱：半制備型：5 μm，250 (10.0 mm，分析型，分析型：5 μm，250 mm× 4.6 mm(美國Epic C18)；P-1020型旋光測定儀(日本JASCO公司)；QF-510A FT-IR紅外光譜儀(北京北芬-瑞麗分析儀器公司)；V-550 UV/VIS紫外光譜儀(日本JASCO公司)；色譜純乙腈、甲醇(德國Merck公司)；旋轉蒸發儀(EA-52型，上海亞榮生化儀器廠)；硅膠(200～300目)、硅膠GF254薄層板(青島海洋化工有限公司)；所用其他分析純試劑均為天津市科密歐化學試劑有限公司生產；培養皿、96孔板(ACEA，美國)；胰蛋白酶、DMEM高糖培養基(Gibco)、胎牛血清、谷氨酰胺(Biological Industries，以色列)；DMSO(Solarbio)；秋水仙堿(純度99%，阿拉丁試劑公司)；水為超純水，PBS緩沖液等為自配。

中藥青陽參干燥根于2019年3月購買于中國云南省昆明市常真堂制藥有限公司。由廣東醫科大學藥學院茍占平教授鑒定為青陽參干燥根，標本(No.201903)保存于廣東醫科大學藥學院。

1.2 實驗方法

1.2.1 提取和分離

青陽參干燥根15 kg，利用95%乙醇-水(30 L)回流提取4次，每次2 h，然后減壓濃縮得到粗提取物(2.25 kg)。粗提取物溶解于5%HCl甲醇-水溶液(V/V，2∶1，30 L)中，加熱回流反應3 h，然后慢慢滴加10%NaOH水溶液，中和至pH=7.0。然后濃縮去除有機溶劑，加入水稀釋，用乙酸乙酯萃取，濃縮后得到酸水解物(1.48 kg)。取1.0 kg水解物，利用硅膠開放柱色譜，氯仿-甲醇梯度洗脫(95∶1→2∶1，V/V)，分離得到10個餾分(Fr.1～Fr.10)。

餾分Fr.5(132.0 g)利用硅膠開放柱色譜，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫(2∶1→1∶5，V/V)，得到9個子餾分(Fr.5-1～Fr.5-9)。餾分Fr.5-6(14.0 g)利用硅膠開放柱色譜，環己烷/乙酸乙酯梯度洗脫(2∶1→1∶1，V/V)，得到5個子餾分(Fr.5-6-1～Fr.5-6-5)。餾分Fr.5-6-5(450 mg)經制備型高效液相(45%甲醇水，流速3.0 mL/min)得到化合物1(tR= 22.5 min，4.3 mg)；餾分Fr.7(30.7 g)利用硅膠開放柱色譜，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脫(2∶1→1∶2，V/V)，得到9個子餾分(Fr.7-1～Fr.7-9)。餾分Fr.7-8(2.8 g)經制備型高效液相(70%甲醇水，流速3.0 mL/min)得到7個子餾分(Fr.7-8-1～Fr.7-8-7)。餾分Fr.7-8-2(86.1 mg)經制備型高效液相(50%甲醇水，流速3.0 mL/min)得到化合物2(tR= 25.0 min，4.5 mg)。餾分Fr.7-8-3(162.2 mg)經制備型高效液相(55%甲醇水，流速3.0 mL/min)得到化合物3(tR= 22.0 min，22.0 mg)和化合物4(tR= 26.0 min，34.2 mg)。

1.2.2 細胞毒活性測試

選擇對數生長的腫瘤細胞(HeLa、H1299、HepG2和MCF-7)用含10% FBS(胎牛血清)，1%的左旋谷氨酰胺(L-glutamine)，100 units/mL的盤尼西林(penicillin)和100 g/mL的鏈霉素的RPMI 1640培養基培養。將培養的細胞以5 × 103/孔數量接種于96孔板上，每孔100 μL。在含5% CO2的37 ℃孵育箱中培養48 h，加入不同濃度的待篩樣品(化合物1～4和陽性對照秋水仙堿)，同時設溶劑空白對照組，37 ℃培養48 h。將96孔板中的原培養基吸出，加入稀釋的0.5 mg/mL MTT PBS液，100 μL/孔。在37 ℃孵育4 h后，吸出MTT溶液，加入100 μL的DMSO溶劑，100 μL/孔，使形成的甲瓚晶體溶解，在搖床上低速震蕩5 min。然后將96孔板置于酶標儀中570 nm單波長檢測吸光值并計算腫瘤細胞生長抑制率：細胞生長率=(實驗組OD值-空白孔OD值)/(陽性對照組OD值-空白孔OD值)×100%。重復實驗3次，進行量效曲線的繪制和IC50值的計算。

2 結果與分析

2.1 結構鑒定

表1 化合物1的1H 和 13C NMR數據(600和150 MHz，CD3OD)Table 1 1H and 13C NMR data of compound 1(600 and 150 MHz,CD3OD)

圖1 化合物1～4的化學結構Fig.1 The structures of compounds 1-4

圖2 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相關Fig.2 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物3黃色不定型粉末(甲醇)，易溶于氯仿、甲醇等有機溶劑。ESI-MS：m/z383.5 [M + Na]+；提示該化合物分子量為360。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δH：6.97(1H，d，J= 1.2 Hz，H-2)，6.84(1H，dd，J= 8.0，1.2 Hz，H-6)，6.79(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5)，6.74(2H，s，H-2′，6′)，5.51(1H，d，J= 6.4 Hz，H-7)，3.86(3H，s，3′-OCH3)，3.82(3H，s，3-OCH3)，3.84(1H，m，H-9b)，3.76(1H，m，H-9a)，3.59(2H，m，H-9′)，3.48(1H，m，H-8)，2.64(2H，m，H-7′)，1.84(2H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δC：134.8(s，C-1)，110.6(d，C-2)，149.0(t，C-3)，147.5(t，C-4)，116.1(d，C-5)，119.7(d，C-6)，89.0(d，C-7)，55.4(d，C-8)，65.0(t，C-9)，56.8(q，3-OCH3)，136.9(s，C-1′)，114.1(d，C-2′)，145.2(s，C-3′)，147.4(s，C-4′)，129.9(s，C-5′)，117.9(d，C-6′)，32.9(t，C-7′)，35.8(t，C-8′)，62.2(t，C-9′)，56.4(3′-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[15]，故鑒定化合物3為dehydroconiferyl alcohol。

化合物 4黃色不定型粉末(甲醇)，易溶于氯仿、甲醇等有機溶劑。ESI-MS：m/z413.4 [M + Na]+；提示該化合物分子量為390。1H NMR(400 MHz，CD3OD)δH：6.73(2H，s， H-2′，6′)，6.68(1H，s，H-2，6)，5.50(1H，d，J= 6.4 Hz，H-7)，3.85(3H，s，3′-OCH3)，3.80(6H，s，3，5-OCH3)，3.84(1H，m，H-9b)，3.76(1H，m，H-9a)，3.57(2H，m，H-9′)，3.48(1H，m，H-8)，2.62(2H，m，H-7′)，1.81(2H，m，H-8′)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δC：133.9(s，C-1)，104.2(d，C-2，6)，149.3(s，C-3，5)，137.0(s，C-4，1′)，89.1(d，C-7)，55.5(d，C-8)，65.0(t，C-9)，56.8(q，3，5-OCH3)，114.1(d， C-2′)，145.2(s，C-3′)，147.5(s，C-4′)，129.8(s，C-5′)，117.9(d，C-6′)，32.9(t，C-7′)，35.8(t，C-8′)，62.2(t，C-9′)，56.8(q，3′-OCH3)。以上數據與文獻報道基本一致[15，16]，故鑒定化合物4為5-methoxydehydroconiferyl alcohol。

2.2 體外人癌細胞毒活性測試

本實驗對化合物1～4進行了細胞毒活性評價(見表 2)，測試的人癌細胞株為MCF-7、HCT-116、HeLa和HepG2。在100 μmol/L濃度下進行初篩，化合物1和4無明顯的細胞毒性，而化合物2和3表現出較強的細胞毒性。進一步對化合物2和3的細胞毒活性進行驗證，實驗結果表明化合物2和3對四種人癌細胞株均有較好的抑制生長活性，特別是對肝癌HepG2細胞的抑制活性最好，其IC50值分別達到34.19±5.44和22.52±3.91 μM。

表2 化合物1～4的細胞毒活性Table 2 Cytotoxicity of compounds 1～4

3 討論與結論

由于國內外學者對中藥青陽參的化學成分研究大多數集中于C21甾體苷類成分[3-5]，因此忽略了對其次級苷、苷元或者其他類型成分研究，一定程度上限制了其資源再次利用和開發。對于含有豐富多樣的糖鏈甾體苷類成分，國內外已有學者著重研究其次級苷或者苷元，比如通光藤[17]、徐長卿[18]、白首烏[6,19]和黑鰻藤[20]，主要是利用酸催化水解方法，獲得系列具有生物活性次級苷或者甾體苷元。基于文獻成功的先例，本課題組前期采用酸水解催化方法處理青陽參根95%乙醇提取物，從中分離、鑒定了一系列結構新穎、具有抗腫瘤活性的C21甾體苷元[8]。此外，我們發現青陽參根的酸水解物中仍存在微量的其他類型成分。本實驗是通過采用現代色譜學方法對青陽參根的酸水解物中其他類型成分進行分離、鑒定，從中發現了4個木脂素，其中化合物1為新的苯二氫化萘型木脂素。進一步通過MTT法實驗顯示化合物2和3具有一定程度細胞毒活性，特別是對肝癌HepG2細胞，其IC50分別為34.19±5.44和22.52±9.13 μM。因此，本實驗得到的4個木脂素化合物均是首次從該屬植物中發現的，雖然其有可能是天然產物的酸催化水解后產生的脫糖苷衍生物，但在一定程度上反映了青陽參植物中存在木脂素類成分，豐富了其化學結構類型，同時為青陽參的資源化利用提供理論基礎，也為尋找新的生物活性天然產物提供新的思路和幫助。