內生真菌Chaetomium globosum S108次生代謝產物分離及黑色素瘤抑制活性研究

張文慧，肖依文,2，梁偉中，汪 涯，高波良，朱 篤,2*

1江西科技師范大學生命科學學院 江西省生物加工過程重點實驗室，南昌 330013；2江西師范大學 江西省亞熱帶植物資源保護與利用重點實驗室，南昌 330022

植物內生菌(edophytes)是指一類生活在健康植物組織體內但不引起植物感染病害的微生物，其不僅能促進植物的耐鹽、耐旱、耐寒、抗蟲等抗逆性，而且蘊含豐富的次生代謝產物合成基因簇，已成為結構多樣性天然產物篩選的重要來源[1,2]。東鄉野生稻(OryzarufipogonGriff.)是僅殘存于江西省東鄉縣、世界分布最北的野生稻，由于其長期處于野生狀態，經歷了自然選擇，具有良好的抗逆性、抗病蟲害、耐寒、耐旱、高產等優良性狀[3,4]。本課題組前期對東鄉野生稻內生真菌多樣性進行了系統的研究，發現其不僅蘊含豐富的植物內生真菌，而且PKS基因檢測和植物病原抑制活性篩選結果顯示其中含有較豐富的活性次級代謝產物，十分有必要進一步開展研究[5]。

本研究以前期從東鄉野生稻中分離得到的一株內生球毛殼菌S108(ChaetomiumglobosumS108)為對象，對其進行發酵培養，初步發現其發酵液對腫瘤細胞具有一定的抑制活性。據文獻報道，球毛殼菌素(chaetoglobosin)是球毛殼菌抑制腫瘤細胞的主要物質[6]。為了進一步探究S108發酵液中具腫瘤抑制活性的化合物，我們對其次生代謝產物進行了分離純化，對分離所得的化合物進行結構鑒定，并進行黑色素瘤抑制活性試驗，以期發現具有潛在活性的化合物，這對于豐富球毛殼菌次生代謝產物及其功能多樣性具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

1.1.1 菌株材料

內生菌S108分離樣品采集自江西省東鄉縣崗上積鎮(N28°14′，E116°36′)野外健康的東鄉野生稻的莖部，現保存于江西省生物加工過程重點實驗室。ITS-rRNA序列比對結果顯示，該菌株與球毛殼菌C.globosum序列同源性高達99%(accession number：KF558876)，因而將其歸屬為C.globosum。

1.1.2 培養基

土豆葡萄糖瓊脂(PDA)培養基(g/L)：200 g土豆、葡萄糖20 g、瓊脂20 g，121 ℃滅菌25 min。土豆葡萄糖肉湯(PDB)培養基(g/L)：200 g土豆，葡萄糖20 g，121 ℃滅菌25 min。大米培養基：大米80 g，蒸餾水120 mL，121 ℃滅菌25 min。

1.1.3 主要儀器與試劑

Bruker AV-400和AV-600核磁共振波譜儀(德國Bruker公司)；AB5600+QTOF高分辨液質聯用儀(美國SCIEX公司)；PURIFLASH450中壓層析系統(法國Interchim公司)；Waters 1525 型超高效液相(美國Waters公司)；Waters 2489 型半制備液相(美國Waters公司)；Spectramax M2酶標儀(美國分子儀器公司)；分析型色譜柱ODS-C18(250 mm×4.6 mm，日本YMC公司)；制備型色譜柱ODS-C18(250 mm×10 mm，日本YMC公司)；正相色譜硅膠(青島海洋化工廠)；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20(美國Amersham公司)；色譜級純甲醇、乙腈(德國Merck公司)；分析純甲醇、乙酸乙酯、乙腈、石油醚、二氯甲烷、無水乙醇、75%乙醇(天津市永大化學試劑開發中心)；色譜純甲醇、乙腈(德國Merck公司)；小鼠黑色素瘤細胞B16(武漢普諾賽生命科技有限公司)；威羅菲尼(vemurafenib，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

1.2 真菌活化及培養

將菌株S108接種至PDA培養基中培養4天使其活化(28 ℃)，待菌落長滿平板后，挑取一小塊培養基接入到含有100 mL種子培養基(PDB)的250 mL三角瓶中培養5天后得到種子培養液(28 ℃，160 rpm)，把種子培養液接種到40瓶大米發酵培養基中，每瓶接種量為5 mL，靜置培養40天(28 ℃)。

1.3 提取與分離

菌株S108培養40天后，收集發酵產物加入80%乙醇超聲波輔助提取4次，收集提取液將其減壓濃縮至3 L便于下一步的提取，再用乙酸乙酯萃取4次后收集萃取液減壓濃縮獲得5.2 g乙酸乙酯相提取液浸膏。浸膏使用200～300正相硅膠進行分離，流動相為石油醚∶乙酸乙酯(5∶1→1∶1)，TLC指示合并得到組分A～E。B組分(石油醚∶乙酸乙酯=4∶1)用正相硅膠柱(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1→2∶1)洗脫得到亞組份B1～B4，其中B2組分用制備液相(乙腈∶水=95∶5)純化得到化合物1(2 mg，tR=10 min)，B4組分用制備液相(乙腈∶水=8∶2)純化得到化合物2(1.2 mg，tR=14 min)。組分C(石油醚∶乙酸乙酯=3∶1)經正相硅膠柱洗脫(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1→6∶1)得到亞組分C1～C3，C3組分經制備液相(乙腈∶水=6∶1)純化分別得到化合物3(1.8 mg，tR=7 min)，化合物4(1.2 mg，tR=18 min)和化合物5(2 mg，tR=22 mim)。組分D(石油醚∶乙酸乙酯=1∶1)經正相硅膠柱洗脫(石油醚∶乙酸乙酯=5∶1→4∶1)得到亞組分D1～D5，D2組分用制備液相(乙腈∶水=3∶7)純化得到化合物6(1.8 mg，tR=8 min)，D5組分用制備液相(乙腈∶水=3∶7)純化得到化合物7(2.2 mg，tR=13 min)。

1.4 黑色素瘤B16細胞活力試驗

黑色素瘤細胞抑制活性實驗參考文獻方法[7]。首先，將對數生長期的小鼠黑色素瘤B16細胞按照密度為4×104/mL的細胞懸液均勻地接種到96孔板中，100 μL/孔，5%CO2、37 ℃孵育24 h使細胞穩定生長。待測化合物1～7用DMSO稀釋至1 mg/mL，后用含有10%胎牛血清(FBS)的培養基稀釋成不同的濃度(2.5、5、10 μM)后加入96孔板中，各濃度平行試驗6次。陽性對照加入威羅菲尼，空白對照組加入培養基，同時再設置一組對照組加入0.2%的DMSO，在培養24 h和48 h后，再分別加入CCK-8試劑(10 μL/孔)，于培養箱中孵育4 h后，用酶標儀于450 nm處測其OD值，根據公式：細胞抑制率=(對照組平均OD值-實驗組平均OD值)/(對照組平均OD值-空白組平均OD值)×100%，計算細胞抑制率。

2 結果和分析

2.1 結構鑒定

化合物1白色粉末,溶于甲醇；分子式為C24H38O4；HR-ESI-MS：m/z391.271 8 [M+H]+，m/z413.252 8 [M +Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：7.73(2H，dd，J=7.4，2.4 Hz，H-3，H-6′′)，7.64(2H，m，H-4′′，H-5′′)，4.23(4H，d，J=4.2 Hz，2×OCH2)，1.73～1.68(1H，m，H-2，H-2′)，1.45(2H，dd，J=12.7，6.6 Hz，H-3)，1.42～1.38(2H，m，H-4，H-4′)，1.36(4H，d，J=3.9 Hz，H-5，H-5′，H-7，H-7′)，0.96～0.97(6H，m，H-6，H-6′，H-8，H-8′)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：67.7(C-1，C-1′)，38.8(C-2，C-2′)，30.2(C-3，C-3′)，28.8(C-4，C-4′)，22.7(C-5，C-5′)，10.0(C-6，C-6′)，23.6(C-7，C-7′)，13.0(C-8，C-8′)，132.2(C-1′′，C-2′′)，128.5(C-3′′，C-6′′)，131.0(C-4′′，C-5′′)，168.0(C=O)。以上數據與文獻[8]報道一致，故鑒定該化合物為dioctyl phthalate(結構見圖1)。

圖1 化合物1～7的化學結構Fig.1 The chemical structures of compounds 1-7

化合物2淡黃油狀,溶于氯仿；分子式為C10H10O4；HR-ESI-MS：m/z195.065 8 [M+H]+，m/z217.046 6 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ：6.25(1H，d，J=2.2 Hz，H-3)，6.21～6.16(1H，m，H-9)，4.65(1H，ddd，J=9.5，6.2，5.4 Hz，H-5)，2.94～2.68(2H，m，H-8)，1.48(3H，d，J=6.3 Hz，H-10)；13C NMR(150 MHz，CD3OD)δ：170.3(C-1)，164.6(C-3)，164.0(C-5)，141.6(C-2)，106.9(C-4)，101.4(C-6)，100.4(C-7)，75.7(C-9)，34.6(C-8)，20.4(C-10)。以上數據與文獻[9]報道一致，故鑒定該化合物為6-hydroxymellein。

化合物3黃色粉末,溶于氯仿；分子式為C23H27O6Cl；HR-ESI-MS：m/z435.156 9 [M+H]+，m/z457.138 7 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：7.28(1H，s，H-1)，6.55(1H，s，H-4)，2.98(1H，d，J=10.0 Hz，H-8)，6.06(1H，d，J=15.5 Hz，H-9)，6.52(1H，dd，J=15.5，6.5 Hz，H-10)，2.26(1H，m，H-11)，1.43(2H，m，H-12)，0.91(3H，t，J=7.5 Hz，H-13)，1.40(3H，s，7-Me)，1.08(3H，d，J=6.5 Hz，11-Me)，3.08(1H，d，J=10.0 Hz，H-1′)，1.90(1H，dq，J=10.2，6.5 Hz，H-3′)，4.30(1H，dq，J=10.2，6.2 Hz，H-4′)，1.41(3H，d，J=6.2 Hz，H-5′)，1.13(3H，d，J=6.5 Hz，3′-Me)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：145.6(C-1)，157.7(C-3)，105.0(C-4)，140.5(C-4a)，110.1(C-5)，189.2(C-6)，84.0(C-7)，50.5(C-8)，114.3(8a)，120.2(C-9)，146.9(C-10)，38.9(C-11)，29.2(C-12)，11.7(C-13)，23.3(C-7-Me)，19.4(C-11-Me)，58.2(C-1′)，104.2(C-2′)，44.9(C-3′)，76.9(C-4′)，18.6(C-5′)，8.8(C-3′-Me)，170.5(C-1′′)。以上數據與文獻[10]報道一致，故鑒定該化合物為chaetomugilin D。

化合物4黃色粉末，溶于丙酮;分子式為C23H27O6Cl。HR-ESI-MS：m/z435.156 1 [M+H]+，m/z457.138 2 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，(CD3)2CO)δ：7.40(1H，s，H-1)，6.55(1H，s，H-4)，2.98(1H，d，J=10.1 Hz，H-8)，6.03(1H，d，J=15.8 Hz，H-9)，6.48(1H，dd，J=15.8，8.2 Hz，H-10)，2.26(1H，m，H-11)，1.42(2H，m，H-12)，0.90(3H，t，J=7.4 Hz，H-13)，1.49(3H，s，7-Me)，1.08(3H，d，J=6.7 Hz，11-Me)，3.03(1H，d，J=10.1 Hz，H-1′)，1.90(1H，dq，J=10.0，6.9 Hz，H-3′)，4.21(1H，dq，J=10.0，6.4 Hz，H-4′)，1.38(3H，d，J=6.4 Hz，H-5′)，1.07(3H，d，J=6.9 Hz，3′-Me)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：145.6(C-1)，157.7(C-3)，105.0(C-4)，140.4(C-4a)，110.1(C-5)，189.2(C-6)，84.0(C-7)，50.6(C-8)，114.3(8a)，120.2(C-9)，146.9(C-10)，38.9(C-11)，29.2(C-12)，11.7(C-13)，23.2(C-7-Me)，19.4(C-11-Me)，170.6(C-1′)，58.3(C-2′)，104.2(C-3′)，44.9(C-4′)，76.9(C-5′)，18.7(C-6′)，8.8(4′-Me)。以上數據與文獻[11]報道一致，故鑒定該化合物為chaetomugilin S。

化合物5黃色粉末，溶于丙酮;分子式為C23H25O6Cl。HR-ESI-MS：m/z433.140 1 [M+H]+，m/z455.122 3 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，(CD3)2CO)δ：7.27(1H，s，H-1)，6.55(1H，s，H-4)，2.98(1H，d，J=10.1 Hz，H-8)，6.06(1H，d，J=15.8 Hz，H-9)，6.52(1H，dd，J=15.8，8.2 Hz，H-10)，2.26(1H，m，H-11)，1.42(2H，m，H-12)，0.90(3H，t，J=7.4 Hz，H-13)，1.41(3H，s，7-Me)，1.08(3H，d，J=6.7 Hz，11-Me)，3.03(1H，d，J=10.1 Hz，H-1′)，1.90(1H，dq，J=10.0，6.9 Hz，H-3′)，4.30(1H，dq，J=10.0，6.4 Hz，H-4′)，1.41(3H，d，J=6.4 Hz，H-5′)，1.13(3H，d，J=6.9 Hz，3′-Me)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：201.2(C-3′)，183.4(C-6)，167.9(C-1′)，162.7(C-8)，157.1(C-3)，151.5(C-1)，148.0(C-10)，139.7(C-4a)，125.1(C-2′)，119.8(C-9)，110.4(C-8a)，108.9(C-5)，105.4(C-4)，87.6(C-7)，70.9(C-5′)，51.0(C-4′)，39.0(C-11)，29.1(C-12)，26.2(CH3-C7)，21.4(CH3-C4′)，19.3(CH3-C11)，13.5(C-6′)，11.7(C-13)。以上數據與文獻[12]報道一致，故鑒定該化合物為chaetoviridin A。

化合物6黃色粉末，溶于丙酮;分子式為C32H36O5N2。HR-ESI-MS：m/z551.251 3 [M+Na]+；1H NMR(600 MHz，(CD3)2CO)δ：6.27(1H，s，NH-2)，3.87(1H，m，H-3)，3.13(1H，dd，J=8.6，3.7 Hz，H-4)，1.89(1H，m，H-5)，2.83(1H，d，J=3.9 Hz，H-7)，2.23(1H，m，H-8)，2.86(1H，dd，J=8.0，4.2 Hz，Ha-10)，2.54(1H，dd，J=15.0，7.9 Hz，Hb-10)，1.15(3H，d，J=6.5 Hz，H-11)，1.27(3H，s，H-12)，6.17(1H，dd，J=10.0，15.0 Hz，H-13)，5.11(1H，m，H-14)，2.20(1H，m，Ha-15)，1.80(1H，m，Hb-15)，2.41(1H，m，H-16)，5.49(1H，d，J=9.1 Hz，H-17)，5.09(1H，s，H-19)，6.57(1H，d，J=16.7 Hz，H-21)，7.62(1H，d，J=16.7 Hz，H-22)，1.10(3H，d，J=5.6 Hz，Me-16)，1.39(3H，s，Me-18)，3.71(1H，d，J=2.7 Hz，OH-19)，8.13(1H，s，NH-1′)，6.85(1H，s，H-2′)，7.39(1H，d，J=7.2 Hz，H-4′)，7.14(1H，t，J=7.5 Hz，H-5′)，7.19(1H，t，J=7.5 Hz，H-6′)，7.29(1H，d，J=7.4 Hz，H-7′)；13C NMR(150 MHz，(CD3)2CO)δ：201.0(C-20)，197.8(C-23)，172.8(C-1)，138.9(C-17)，136.7(C-1′a)，135.7(C-21)，132.7(C-22)，132.6(C-14)，132.2(C-18)，128.9(C-13)，127.8(C-3′a)，124.2(C-5′)，121.2(C-2′)，118.9(C-6′)，118.5(C-4′)，111.4(C-7′)，109.7(C-3′)，63.2(C-9)，62.0(C-7)，57.2(C-6)，52.2(C-3)，48.3(C-8)，46.7(C-4)，41.3(C-15)，36.4(C-5)，33.2(C-10)，32.0(C-16)，20.4(CH3-C16)，12.3(CH3-11)，9.8(CH3-C18)。以上數據與文獻[13]報道一致，故鑒定該化合物為chaetoglobosin A。

化合物7淡黃色粉末，溶于丙酮;分子式為C15H18O6。HR-ESI-MS：m/z293.090 4 [M-H]-；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：12.20(1H，s)，6.59(1H，d，J=2.3 Hz，H-4′)，6.43(1H，d，J=2.4 Hz，H-2′)，4.93(1H，d，J=2.9 Hz，H-4)，4.02(1H，dd，J=11.6，8.3 Hz，H-5)，3.86(3H，s，H-8)，3.79(1H，dd，J=11.6，8.6 Hz，H-5)，3.08～3.02(1H，m，H-2)，3.00(1H，d，J=3.1 Hz，H-3)，2.08(1H，d，J=11.8 Hz，H-7)，1.97(1H，dd，J=11.9，4.2 Hz，H-7)，1.56(3H，s，H-9)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：202.9(C-1)，166.6(C-1′)，165.2(C-3′)，140.3(C-6′)，110.0(C-2′)，108.6(C-4′)，106.4(C-5′)，101.7(C-6)，76.9(C-4)，62.9(C-5)，55.8(C-8)，44.9(C-3)，39.9(C-2)，39.1(C-7)，23.8(C-9)。以上數據與文獻[14]報道一致，故鑒定該化合物為6-O-demethyl-5-deoxyfusarubin。

2.2 黑色素瘤B16細胞活力試驗

將分離純化后獲得的7個單體化合物進行黑色素瘤B16細胞活力影響試驗，結果顯示，當各化合物濃度均為5 μmol/L時，僅有化合物2對黑色素瘤B16細胞有一定的抑制活性，其余化合物未見明顯抑制腫瘤細胞增殖作用。如表1所示，當化合物2的濃度為2.5 μmol/L時，與對照組相比黑色素瘤B16細胞存活率有明顯下降，且隨濃度的增加，對B16細胞殺傷能力隨之增強，在藥物濃度達到10 μmol/L時，細胞死亡最多，其IC50值為2.24 μmol/L，與陽性對照威羅菲尼(vemurafenib)相比，化合物2顯示出良好的抑制效果；在作用48 h后，仍有良好的抑制作用，且隨濃度的增大B16細胞存活率有明顯的降低，其IC50值為2.28 μmol/L。

表1 化合物2對黑色素瘤B16細胞的抑制率(n=6)Table 1 Inhibition rate of compound 2 on melanoma B16 cells (n=6)

3 討論

C.globosum為毛殼菌科、毛殼菌屬真菌，自1973年Sekita從C.globosum中分離到球毛殼菌素A和B以來，已從球毛殼菌屬中發現了400多個結構新穎的活性次級代謝產物，這些化合物主要包括球毛殼菌素類、嗜氮酮類、萜類、酯類、黃酮類、異香豆素類等[15]，其中球毛殼菌素類與嗜氮酮類化合物占絕大多數，而異香豆素類等其他化合物則較少被分離，僅Yan等[16]從銀杏來源的球毛殼菌中分離到異香豆素類化合物prochaetoviridin A。本研究從S108中分離得到chaetomugilin D(3)、chaetomugilin S(4)、chaetoviridins A(5)等3個嗜氮酮類化合物以及該菌中常見的生物堿類化合物球毛殼素A(6)，同時從中分離到異香豆素類化合物6-hydroxymellein(2)及萘醌類化合物6-O-demethyl-5-deoxyfusarubin(7)，化合物2和7均為首次從毛殼菌屬真菌中分離得到。6-Hydroxymellein(2)是一種常見的生物合成中間體，微生物以其為前體可以合成眾多的結構類似物[17]，這表明S108基因組中可能含有相關的聚酮合成酶(PKS)基因簇，開展S108的次級代謝產物的進一步挖掘，有望從中分離出新結構、新活性的化合物。

本研究從球毛殼菌C.globosumS108中分離純化得到的7個化合物，其生物活性已有較多報道，chaetomugilin D(3)、chaetomugilin S(4)、chaetoviridins A(5)等嗜氮酮類化合物，其中化合物3、4可有效抑制幼苗的生長，如Wang等[18]從一株銀杏來源的球毛殼菌中分離得到的化合物3、4對幼苗生長有明顯的抑制作用，與廣譜除草劑草甘膦相比其IC50更低，因此有待被開發為天然環保型除草劑。化合物5顯示出良好的抗真菌活性，對核盤病菌有良好抑制作用，其防治效果與廣譜殺菌劑多菌靈效果相當[16]。球毛殼素A(6)亦顯示了較好的抗癌活性，如Knudsen等[19]研究發現從青霉菌中分離到的化合物6可作為治療慢性淋巴白血病(CLL)的潛在藥物，在模擬淋巴組織的培養條件下，也表現出顯著的誘導CLL細胞凋亡作用。目前，有關6-O-demethyl-5-deoxyfusarubin(7)活性未有報道，但其類似物鐮紅菌素具有抑制血液腫瘤細胞系的增殖并增加細胞凋亡的作用[20]。本研究以黑色素瘤B16細胞為對象，開展化合物抑制腫瘤細胞的評價，結果表明，除化合物2外，其他6種化合物均對黑色素瘤B16細胞沒有抑制作用。

迄今，6-hydroxymellein(2)僅從紅樹的內生真菌褐瘤菌(Daldiniaeschscholtzii)和土曲霉(Aspergillusterreus)中分離得到，發現其對擬南芥花粉發育有抑制作用[9,21]。此外，Yang等[22]發現化合物2對于人乳腺癌細胞MDA-MB-231和人胰腺癌細胞PANC-1無抑制作用，對非小細胞肺癌細胞A549和人肝癌細胞BEL-7402僅有微弱的抑制活性，其IC50分別為170.6 mg/L和315.0 mg/L。本研究首次發現6-hydroxymellein(2)對黑色素瘤B16細胞有良好的抑制活性，IC50為2.24 μmol/L。黑色素瘤作為臨床上常見的皮膚惡性腫瘤，病惡性程度高、易轉移，發病率有逐年增加趨勢[23]，因此6-hydroxymellein(2)新活性的發現有助于黑色素瘤治療藥物的研發，同時為治療黑色素瘤藥物開發提供了新思路。