香葉天竺葵精油和羅勒精油的抗抑郁功效及其作用機制研究

劉曉生，王郁玲，馬瑞君，刁遠明，張潔文，吳清韓*

1廣州中醫藥大學基礎醫學院，廣州 510006；2廣州市城市建設職業學校，廣州 510320；3韓山師范學院生命科學與食品工程學院，潮州 521041；4中山大學第一附屬醫院，廣州 510006

抑郁癥是一種由多種因素引起的，可對人的情緒、行為產生負面影響的慢性心理疾病。具有發病率高、致殘率高等特點。近幾年來，隨著生活節奏日益加快，社會競爭壓力逐漸增大，它已成為現代社會最常見的心理疾病之一[1]。因為目前臨床使用的抗抑郁藥物主要是單胺氧化酶(MAO)抑制劑、選擇性5-羥色胺重吸收抑制劑(SSRI)、非典型抗抑郁藥、三環和四環類抗抑郁藥物這四大類化學合成藥物，它們雖然對各種程度抑郁癥具有一定的治療效果，但均普遍存在抗抑郁譜窄、藥價高、副作用大等弊端[2-4]。另一方面，已有研究表明以中醫藥理論為支撐的天然芳香類中草藥植物在治療抑郁癥方面有著豐富經驗和獨特療效。如Shen等[5]研究發現大鼠吸入薰衣草精油可影響自主神經系統，調節大鼠情緒。Park等[6]證實細辛精油對緩解小鼠抑郁癥狀具有一定效果。Yang等[7]發現嗅聞甜橙精油能有效緩解實驗小鼠抑郁癥樣。Wang等[8]初步證實復方精油香氣經由人體嗅吸對抑郁癥康復具有一定輔助干預作用。Fernandez等[9]證實薰衣草精油對女性產后抑郁癥狀緩解能起很大作用。因而從天然芳香類中草藥植物中探尋高療效、毒副作用小的抗抑郁藥用活性成分，日益受到國內外學者的重視。

本研究所選取的兩種常見芳香類中草藥植物：羅勒(OcimumbasilicumL.)和香葉天竺葵(Pelargoniumgraveolens)，均有安撫神經緊張、平撫焦慮沮喪心情之功效[10,11]。目前有關這兩種植物的研究，主要是對其精油(essential oil，EO)成分分析[12,13]、抗菌性[14,15]、抗氧化活性[16,17]等方面的報道。而關于其抗抑郁功效研究除了Khalaj等[18]用小鼠強迫游泳試驗發現香葉天竺葵精油對緩解抑郁癥具有一定功效外，國內外還鮮有其他相關研究報道。本文擬采用兩種“行為絕望抑郁”模型小鼠尾懸掛試驗和小鼠強迫游泳試驗，測定各實驗組小鼠不動時間變化；皮質酮誘導PC12細胞損傷模擬抑郁癥患者人腦神經元損傷狀態，并通過相關抑制劑預處理，檢測細胞損傷程度。分別從動物和細胞水平對香葉天竺葵和羅勒的精油的抗抑郁功效及其可能的信號通路進行研究，以期為研發具抗抑郁功效的芳香類中草藥植物精油產品奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

香葉天竺葵精油和羅勒精油(濃度均為99.9%)，由韓山師范學院植物資源研究所提供。昆明種小鼠，SPF級，雌雄各半，體重18～22 g，由汕頭大學醫學院提供。鹽酸氟西汀(Sigma，純度98%，貨號：F0253000)；DMEM培養基(Gibco，貨號：11965092)；胎牛血清(四季青，貨號：22011-8612)；D-HANKS(Gibco，貨號：10010072)；MTT試劑(Gibco，貨號：M6494)；胰酶(Gibco，貨號：25200056)；Perifosine(碧云天，純度98%，貨號：SC0227-10mM)；LY294002(碧云天，純度98%，貨號：S1737-1mg)；H-89(碧云天，純度98%，貨號：S1643-1 mg)；皮質酮(阿拉丁，純度98%，貨號：C119329-100 mg)；DMSO(Sigma，純度99.9%，貨號：276855)。PC12細胞(腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞株)由廣州中醫藥大學基礎醫學院實驗教學中心提供。YLS-1C小動物活動記錄儀(北京金洋萬達科技有限公司);計時器(TaKaRa);imark酶標儀(美國伯樂);CKX41倒置顯微鏡(日本Olymapus);AXTGL 16M離心機(鹽城市安信實驗儀器有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物實驗方法

動物試驗飼養方式如下：自由進食飲水，室溫26～27 ℃，每日保持12 h/12 h晝夜規律。

1.2.1.1 小鼠自主運動試驗

參考Deng等[19]方法。將篩選合格的80只小鼠，隨機分成8組，每組10只。先適應飼養2天。第3天到第8天中，先對各實驗組進行不同方式灌胃處理。其中正常生理鹽水組(空白對照組)以及氟西汀陽性對照組均每天灌胃給予生理鹽水，1天1次，每次灌胃劑量0.25 mL/10 g；香葉天竺葵和羅勒精油組每天灌胃給予特定劑量的精油(小劑量組0.24 mL/kg、中劑量組0.36 mL/kg、高劑量組0.48 mL/kg)。實驗時，將精油溶于0.9%生理鹽水中，配制成各劑量精油相應濃度的溶液，灌胃前振蕩均勻。每天灌胃一次，每次灌胃劑量為0.25 mL/10 g。第9天，除了氟西汀陽性對照組灌胃給予鹽酸氟西汀，劑量為40 mg/kg，灌胃量為0.25 mL/10 g外。其他組仍按照之前的給藥劑量和方式分別進行灌胃。在各組小鼠給藥30 min后，使用YLS-1C小動物活動記錄儀，記錄每個籠子里的小鼠5 min內的自主活動次數。

1.2.1.2 小鼠尾懸掛試驗

參考Deng等[19]方法并改進。將篩選合格的90只小鼠，隨機分成9組，每組10只。適應飼養2天。第3天到第9天中，先對各實驗組進行不同方式灌胃處理，除正常組小鼠不做尾懸外，其他8組小鼠都通過小鼠尾懸，利用小鼠不能逃逸出惡劣環境，導致其產生行為絕望的抑郁小鼠。其中正常組(未尾懸組)，生理鹽水組(空白對照組)以及氟西汀陽性對照組、香葉天竺葵和羅勒精油組每天灌胃均參照本文“1.2.1.1”項。8組小鼠進行小鼠尾懸掛不動時間的測定：根據Steru等[20]建立的方法，加以改進。實驗第9天，進行小鼠尾懸掛不動時間的測定。試驗前30 min，除了氟西汀陽性對照組灌胃給予鹽酸氟西汀，劑量為40 mg/kg，灌胃量為0.25 mL/10 g外。其他組仍按照之前的給藥劑量和方式分別進行灌胃。試驗時，除正常組小鼠不做尾懸，記錄正常活動狀態下小鼠在6 min之內的后5 min內的累計不動時間外，其他8組小鼠分別將小鼠尾部1 cm處的部分固定于自制的懸尾支架上，使小鼠呈倒掛狀態，其頭部離底部約5 cm，四周以紙板隔離小鼠視線。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動，但活動一段時間后出現間斷性不動，表現出失望狀態。觀察各組小鼠在6 min之內的后5 min內的累計不動時間，即為失望時間，其判定不動標準是動物停止掙扎，身體呈垂直倒懸狀態，靜止不動[21]。

1.2.1.3 小鼠強迫游泳試驗

將100只昆明小鼠(雌雄各半)，先適應飼養2天。第3天單個放入垂直放置的盛水的有機玻璃大燒杯中(高22 cm×直徑13 cm，水深12 cm，水溫25 ℃)，預試15 min后將小鼠烘干。剔除預試中不合格者，將篩選的合格90只小鼠隨機分成9組，每組10只。試驗第3天到第9天的實驗分組和給藥劑量，參照本文“1.2.1.2”項。其中8組小鼠強迫游泳不動時間的測定：參考Porsolt方法[17]，并做一些改進。試驗的第9天，試驗前30 min，氟西汀陽性對照組灌胃用量與小鼠尾懸掛試驗中的一致，其他組仍也按以前的給藥方式和劑量分別進行灌胃。試驗時，除正常組小鼠不做強迫游泳實驗，記錄正常活動狀態下小鼠在6 min之內的后5 min內的累計不動時間外，其他8組小鼠分別在與預試驗相同實驗條件下，測定各組小鼠強迫游泳6 min之內后5 min的累計不動時間。其判定不動標準是小鼠微卷軀體，但保持垂直姿勢，鼻孔露出水面[23]。

1.2.2 細胞實驗方法

1.2.2.1 細胞培養

復蘇的PC12細胞使用預先配好的DMEM完全培養基(含有10%胎牛血清和1%雙抗)進行分裝培養，每隔1天換液一次。

1.2.2.2 實驗分組

PC12細胞用0.25%胰酶消化重懸，制備細胞懸液(1×105個/mL)。制備現配精油：100 μL精油加入DMSO中定容至1 mL混合成現配精油。96孔板上隨機劃分14組(每組3個復孔，100 μL/孔)，培養24 h后，待細胞長滿孔底，棄舊液，換成不含胎牛血清的基礎培養液，進行饑餓處理1 h。1 h后棄舊液，其中空白對照組進行正常的換液，無任何添加；皮質酮損傷細胞模型組(CORT)加入含0.1 mmol/L皮質酮(CORT)的培養液；各精油組各孔均先加入相應劑量現配精油，預處理細胞1 h，之后再加入基礎培養液和皮質酮母液，使各孔皮質酮終濃度為0.1 mmol/L，精油組各孔的精油終濃度為60、70、80 μL/mL。其中，Pg60為香葉天竺葵精油組(60 μL/mL)；Pg70為香葉天竺葵精油組(70 μL/mL)；Pg80為香葉天竺葵精油組(80 μL/mL)；Ob60為羅勒精油組(60 μL/mL)；Ob70為羅勒精油組(70 μL/mL)；Ob80為羅勒精油組(80 μL/mL)。另外，抑制劑組各孔均先加入相應劑量現配信號通路抑制劑預處理細胞1 h，其中PI3K信號通路抑制組(PI3K組)加入通路抑制劑LY294002(50 μM/100 μL)。其中，AKt信號通路抑制組(AKt組)加入通路抑制劑KRX-0401(100 μM/100 μL)，PKA信號通路抑制組(PKA組)加入通路抑制劑H-89(50 μM/100 μL)。再分別加入相應劑量現配精油預處理細胞1 h，之后再加入基礎培養液和皮質酮母液共處理24 h，使各精油組的精油終濃度為70 μL/mL。處理結束后進行MTT assay檢測細胞存活狀態。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 香葉天竺葵精油和羅勒精油對小鼠自主活動的影響

如表1所示，各精油實驗組的小鼠自主活動次數，與氟西汀陽性對照組和生理鹽水空白對照組比較，自主活動次數均沒有顯著性增加，表明本實驗中香葉天竺葵精油和羅勒精油縮短小鼠尾懸和強迫游泳的不動時間所具有的抗抑郁作用與提高小鼠中樞神經系統興奮性無關。

表1 主運動試驗中各組小鼠的自主活動次數Table 1 The spontaneous locomotor activity of mice in each experimental

2.2 小鼠尾懸掛試驗結果

如表2所示，在小鼠尾懸掛試驗中，與正常組(未懸尾組)相比，懸尾造模的生理鹽水空白對照組的模型小鼠的不動時間顯著增加，并表現出停止掙扎，身體呈垂直倒懸狀態，靜止不動的抑郁狀態。另外，抑郁小鼠的不動時間減少最明顯的實驗組依次為：羅勒精油中劑量組(0.36 mL/kg)、氟西汀陽性對照組、羅勒精油高劑量組(0.48 mL/kg)、香葉天竺葵精油高劑量組(0.48 mL/kg)，與生理鹽水空白對照組相比，不動時間分別縮短了79.07%、75.75%、69.72%、64.75%。在香葉天竺葵精油各試驗組中，香葉天竺葵精油高劑量組的效果最好，精油高劑量組的效果要好于低劑量組(0.24 mL/kg)的；在羅勒精油各試驗組中，精油中高劑量組的效果比精油小劑量組的效果好。

表2 小鼠尾懸掛試驗中各組小鼠的不動時間Table 2 The motionless time of mice in each experimental group on the

2.3 小鼠強迫游泳試驗結果

如表3所示，在小鼠強迫游泳試驗中，與正常組(未強迫游泳)相比，強迫游泳造模的生理鹽水空白對照組的模型小鼠的不動時間顯著增加，并表現出微卷軀體，保持垂直姿勢，鼻孔露出水面的不動抑郁狀態。另外，抑郁小鼠的不動時間減少最明顯的實驗組依次為：香葉天竺葵精油中劑量組，羅勒精油高劑量組、羅勒精油中劑量組、香葉天竺葵精油高劑量組，與生理鹽水空白對照組相比，不動時間分別縮短了72.20%、71.37%、70.95%、70.22%。在香葉天竺葵精油各試驗組中，精油中高劑量組效果最好，小劑量效果次之；在羅勒精油各試驗組中，精油高劑量組效果最好、中劑量組和小劑量組分別次之。

表3 各試驗組在小鼠強迫游泳試驗中的不動時間Table 3 The motionless time of mice in each experimental group on the

2.4 香葉天竺葵和羅勒精油對CORT損傷PC12細胞存活率的影響

如圖1所示，與空白組比較，CORT組的PC12細胞存活率顯著降低，說明0.1 mmol/L的CORT能導致細胞損傷，降低細胞存活率。與CORT組相比，香葉天竺葵和羅勒的精油各劑量處理后均能提高PC12細胞存活率，其中低、中劑量精油處理組的效果較好，并以中劑量精油處理組的效果最佳(P<0.05)。

圖1 香葉天竺葵和羅勒精油對CORT損傷PC12細胞存活率的影響Fig.1 Effects of different concentrations of P.graveolens and O.basilicum EO on the viability of 注：與空白對照組比較，*P<0.05；與CORT組比較，a P<0.05。Note:Compared with blank group,*P<0.05;Compared with CORT group,a P<0.05.

2.5 LY294002、KRX-0401和H-89干預對PC12細胞存活率的影響

如圖2所示，PI3K組(PI3K信號通路抑制劑LY294002)AKt組(AKt信號通路抑制劑KRX-0401)PKA組(PKA信號通路抑制劑H-89)分別與香葉天竺葵精油組和羅勒精油組比較，細胞存活率均有顯著的降低，表明兩種精油對CORT損傷PC12細胞的保護作用可能由PI3K/Akt和PKA信號通路介導。

圖2 LY294002、KRX-0401、H-89干預對PC12細胞存活率的影響Fig.2 Inhibition effect of LY294002,KRX-0401 and H-89 on viability of PC12 注：與香葉天竺葵精油組比較，*P<0.05；與羅勒精油組比較，a P<0.05。其中，Pg70+L為70 μL/mL香葉天竺葵精油+LY294002；Pg70+K為70 μL/mL香葉天竺葵精油+KRX-0401；Pg70+H為70 μL/mL香葉天竺葵精油+H-89；Ob70+L為70 μL/mL羅勒精油組+LY294002；Ob70+K為70 μL/mL羅勒精油+KRX-0401；Ob70+H為70 μL/mL羅勒精油+H-89。Note:Compared with P.graveolens EO group,*P<0.05;Compared with O.basilicum EO group,a P<0.05.Pg70+L is 70 μL/mL P.graveolens EO + LY294002;Pg70+K is 70 μL/mL P.graveolens EO + KRX-0401;Pg70+H is 70 μL/mL P.graveolens EO + H-89;Ob70+L is 70 μL/mL O.basilicum EO + LY294002;Ob70+K is 70 μL/mL O.basilicum EO + KRX-0401;Ob70+H is 70 μL/mL O.basilicum EO + H-89.

2.6 香葉天竺葵精油和羅勒精油對CORT損傷PC12細胞形態的改變

如圖3所示，倒置顯微鏡下，空白對照組PC12細胞貼壁生長良好，突觸粗長，細胞呈纖維狀或多角形。CORT組，PC12細胞經CORT處理24 h后，細胞突觸收縮，形態變圓，貼壁數減少，細胞碎片增多。而當給予香葉天竺葵和羅勒這兩種精油后，CORT損傷的PC12細胞形態逐漸恢復，突觸收縮狀況明顯改善。表明這兩種精油能對CORT損傷PC12細胞起到一定的保護作用。

圖3 不同藥物處理組對PC12細胞形態的影響Fig.3 Changes of cell morphologies induced by different drugs注：A：空白對照組；B：皮質酮損傷細胞模型組；C：羅勒精油組；D：香葉天竺葵精油組。Note:A:Blank control group;B:The PC12 cells injured by corticosterone to establish stress injury model;C:O.basilicum EO group (70 μL/mL);D:P.graveolens EO group (70 μL/mL).

3 討論與結論

“行為絕望抑郁模型”是目前評價抗抑郁藥的作用效果最常用的抑郁動物模型。本實驗先采用此模型對香葉天竺葵和羅勒的精油的抗抑郁作用進行初步研究。結果表明香葉天竺葵和羅勒的精油各試驗劑量均能有效的對抗這兩種“行為絕望”模型小鼠的絕望行為，使其不動時間顯著縮短，表現出一定的抗抑郁效果。并且香葉天竺葵精油的抗抑郁效果呈現一定的劑量依賴性，即精油高劑量效果最好，中劑量好于低劑量或與其相近。而羅勒精油的抗抑郁效果并不呈劑量依賴性，高、中劑量組的抗抑郁效果相近，而低劑量組抗抑郁效果次之。鑒于有研究指出，雖然以上兩種“行為絕望”抑郁模型對抗抑郁藥具有高選擇性，但一些增加動物活動性的藥物也可能出現假陽性結果[24]。為避免可能出現的假陽性結果，本實驗還對香葉天竺葵精油和羅勒精油對小鼠自主活動的影響進行研究，結果發現香葉天竺葵精油和羅勒精油的各試驗劑量組與空白對照組的小鼠自主活動次數均無顯著增多。綜上所述，可排除由于自主活動性可能帶來的抗抑郁的假陽性結果，說明這兩種芳香植物的精油各試驗劑量對“行為絕望”模型小鼠有明顯抗抑郁作用。

另有報道，采用高濃度的CORT誘導PC12細胞損傷可模擬抑郁癥患者的腦神經元損傷狀態，并且CORT誘導PC12細胞損傷與細胞中的PI3K/Akt信號通路和PKA信號通路密切相關[25,26]。因此本實驗通過CORT誘導PC12細胞損傷構建皮質酮應激損傷細胞模型，MTT法檢測細胞損傷程度。結果顯示，0.1 mmol/L CORT可使細胞存活率明顯降低，突觸收縮，細胞形態改變。當給予一定劑量的香葉天竺葵精油和羅勒精油后，細胞存活率均顯著提高，細胞形態有所恢復，說明一定劑量的香葉天竺葵精油和羅勒精油能對CORT誘導PC12細胞具有一定的保護作用，且兩種精油的抗抑郁效果并不呈劑量依賴性，以中劑量的效果最佳。另外，當給予PI3K/Akt信號通路阻斷劑LY294002、KRX-0401和PKA信號通路H-89干預時，發現兩種精油對CORT損傷PC12細胞的保護作用均被顯著削弱，表明兩種精油對CORT損傷PC12細胞的保護作用可能由PI3K/Akt和PKA信號通路介導。

已有研究報道，植物的一些揮發性成分決定了植物所擁有的多種生理功效[27]。香葉天竺葵精油的主要成分香茅醇、香葉醇已被證實具有一定抗抑郁功效[28]，羅勒揮發性成分中的蒿腦、芳樟醇、石竹烯也被證實對人體神經系統具有保健功能[29]，但尚未探討其他成分是否具有相似抗抑郁功效。

綜上所述，香葉天竺葵和羅勒的精油具有一定抗抑郁作用，其神經保護作用可能由PI3K/Akt和PKA信號通路介導。本實驗研究將為后期進一步探討這兩種植物精油的抗抑郁有效成分以及對其分子作用機制提供實驗支撐，同時也為研發具抗抑郁功效的芳香類中草藥植物精油產品奠定實驗基礎。