竹葉花椒黃酮類成分含量及抗氧化活性相關(guān)性分析

楊 悅，馮靖雯，陳鴻平，劉友平

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137

竹葉花椒是蕓香科植物竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)的干燥成熟果皮，性辛、溫，具有溫中止痛、殺蟲止癢等功效，俗稱“藤椒”，又名萬花針、白總管、竹葉總管、山花椒等，主要分布在我國秦嶺以南的廣大西南區(qū)域[1,2]。目前四川省栽種面積達(dá)300多萬畝[3]，形成川中、川西、攀西3個花椒特色優(yōu)勢種植區(qū)，攀西及川中地區(qū)為竹葉花椒集中地[4]。

基于清香濃郁的特殊風(fēng)味，竹葉花椒在餐飲行業(yè)流通廣泛，常用作風(fēng)味調(diào)節(jié)劑和防腐劑，防腐作用與抗氧化活性物質(zhì)相關(guān)[5]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，竹葉花椒具有鎮(zhèn)痛抗炎、保肝、抗氧化、驅(qū)蚊殺蟲、抗腫瘤、降血糖、抗阿茲海默癥[6-12]等作用，其中保肝、抗腫瘤、降血糖等藥效作用與竹葉花椒抗氧化活性有關(guān)，目前未有研究表明竹葉椒藥材抗氧化活性與其傳統(tǒng)功效有關(guān)聯(lián)。本課題組前期研究表明，竹葉花椒不同極性部位均具有清除DPPH、ABTS及羥基自由基作用。有文獻報道，不同產(chǎn)地的竹葉花椒均具有較好的抗氧化活性[13]，且自由基清除率、總抗氧化活性和還原電位實驗，三種實驗方法均表明抗氧化作用與提取物劑量呈正相關(guān)[14]。藤椒水提液有很好的抗氧化活性，可能與黃酮類成分的蘆丁、槲皮素等有關(guān)[15]。目前關(guān)于不同產(chǎn)地竹葉花椒黃酮類成分含量差異及其與抗氧化活性相關(guān)性的研究較少。因此，本文收集四川川中、攀西等21個產(chǎn)地的27批竹葉花椒，建立HPLC方法同時測定4種黃酮類成分，紫外測定總黃酮含量，結(jié)合DPPH、ABTS自由基清除試驗評價不同產(chǎn)地竹葉花椒抗氧化活性差異。通過皮爾遜相關(guān)分析法，探究黃酮成分和抗氧化活性的相關(guān)性，旨在為竹葉花椒抗氧化活性研究與大健康衍生品開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

LC-20AT高效液相色譜儀(日本島津公司)；Agilent 8453紫外分光光度計(美國Agilent公司)；BN3000型萬分之一電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；CP2000型十萬分之一電子天平(德國Sartorius公司)；UPTUO-I-1000TE優(yōu)普系列超純水機(成都純水科技有限公司)；SG8200HDT型超聲波清洗機(上海冠特超聲儀器有限公司)；Varioskan flash型酶標(biāo)儀(美國賽默飛世爾科技公司)。

1.2 材料

蘆丁(批號：AF9022006，純度：98%)、金絲桃苷(批號：AF9110614，純度：98%)、槲皮苷(批號：AF20030853，純度：98%)、異槲皮苷(批號：AF9030801，純度：98%)均購自成都埃法生物科技有限公司；乙腈、甲醇(色譜級，美國TEDIA有限公司)；甲酸(分析級，成都金山化學(xué)試劑有限公司)；95%乙醇(分析級，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；過硫酸鉀、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(成都市科隆化學(xué)品有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，上海麥克林生化有限公司)；2,2-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽(ABTS，上海麥克林生化有限公司)；L-抗壞血酸(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；竹葉花椒樣品來源信息見表1，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)嚴(yán)鑄云教授鑒定為蕓香科植物竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)的干燥成熟果皮。

表1 27批竹葉花椒樣品來源信息Table 1 Source information of 27 batches of Z.armatum

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2 方法與結(jié)果

2.1 總黃酮含量測定[16]

2.1.1 對照品溶液制備

精密稱取蘆丁對照品5.43 mg，加甲醇制成1 mL含蘆丁0.543 mg的溶液作為對照品儲備液。

2.1.2 供試品溶液制備[17]

將竹葉花椒粉碎，過3號篩，精密稱定花椒樣品粉末約1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱重，超聲提取30 min，稱重，用甲醇補足重量，過濾，取續(xù)濾液0.1 mL置10 mL容量瓶中，加入5%的NaNO2溶液0.4 mL，搖勻；放置6 min后，再加入10%的Al(NO3)3溶液0.4 mL，搖勻；再放置6 min后，加入1 mol/L的NaOH溶液4 mL，15 min后甲醇定容。

2.1.3 最大吸收波長的選擇

以甲醇按供試品制備方法制備為空白溶液，取供試品溶液在400～800 nm之間掃描，根據(jù)掃描結(jié)果選擇510 nm作為測定波長。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取對照品溶液0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0、1.2 mL至10 mL容量瓶，以甲醇為空白，在510 nm處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：y= 11.835x+ 0.0213，R2= 0.999。

2.1.5 樣品含量的測定

取不同產(chǎn)地竹葉花椒樣品，按“2.1.2”項下制備溶液，在510 nm處測定吸光度，根據(jù)線性回歸方程計算不同產(chǎn)地竹葉花椒中總黃酮含量。

2.2 4種黃酮類成分測定

2.2.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷對照品適量，置5 mL容量瓶中，加甲醇溶解定容，混勻，得到濃度分別為0.1、0.2、0.062、0.154 mg/mL的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備

取竹葉花椒粉末(過3號篩)約1 g，精密稱定，加25 mL甲醇，超聲(500 W，30 kHz)30 min，放冷，稱重，用甲醇補重，過濾，取續(xù)濾液過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.2.3 色譜條件

采用ZORBAX SB C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相：0.1%甲酸水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～5 min，10% B；5～10 min，10%→17% B；10～25 min，17% B；25～30 min，17%→20% B；30～45 min，20% B；45～50 min，20%→30% B；50～55 min，30%→40% B；55～60 min，40%→58% B；60～65 min，58%→100% B)；流速為1.0 mL/min；柱溫為35 ℃；檢測波長為360 nm；進樣量為10 μL。混合對照品溶液及竹葉花椒樣品溶液的HPLC色譜圖見圖1。

圖1 混合對照品溶液(A)及樣品溶液(B)HPLC色譜圖Fig.1 HPLC of mixed reference (A) and test (B) solution 注：1-蘆丁；2-金絲桃苷；3-異槲皮苷；4-槲皮苷。Note:1-Rutin;2-Hyperoside;3-Isoquercitrin;4-Quercetin.

2.2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取混合對照品溶液0.5、1、2、4、6、8、10 μL，分別進樣，記錄HPLC色譜圖。以對照品的質(zhì)量濃度(X，mg/mL)為橫坐標(biāo)，以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程，結(jié)果見表2。

表2 竹葉花椒中4種黃酮成分的線性關(guān)系考察Table 2 Linear relationship of four flavonoids in Z.armatum

2.2.5 方法學(xué)考察

2.2.5.1 精密度試驗

在“2.2.3”色譜條件下，對同一對照品溶液重復(fù)6次進樣進樣量10 μL，計算蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷峰面積的RSD值分別為0.50%、0.54%、0.50%、0.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.5.2 重復(fù)性試驗

取同一批竹葉花椒6份，制備成供試品溶液，在“2.2.3”色譜條件下進樣，計算蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷峰面積的RSD值分別為1.79%、1.88%、1.65%、4.13%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.5.3 穩(wěn)定性試驗

取竹葉花椒供試品溶液，分別在0、2、4、8、12、24 h，按“2.2.3”色譜條件下進樣，計算蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷峰面積的RSD值分別為2.24%、1.91%、2.41%、3.09%，結(jié)果見表3，表明蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表3 竹葉花椒中4種黃酮成分穩(wěn)定性試驗結(jié)果Table 3 Stability test results of four flavonoids in Z.armatum

2.2.5.4 加樣回收率試驗

取一批竹葉花椒樣品6份，精密稱定，加入適量對照品溶液，按“2.2.2”項方法制備供試品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定并計算蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷平均回收率分別為100.97%、101.21%、99.24%、99.01%，RSD值分別為1.31%、3.87 %、3.24%、1.98%，結(jié)果見表4。

表4 竹葉花椒中4種黃酮類成分加樣回收試驗結(jié)果Table 4 Results of recovery test of four flavonoids from Z.armatum

續(xù)表4(Continued Tab.4)

2.2.6 樣品的含量測定

取不同產(chǎn)地竹葉花椒樣品，按“2.2.2”項下制備樣品溶液，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，根據(jù)外標(biāo)一點法計算不同產(chǎn)地竹葉花椒中4種黃酮類成分含量結(jié)果見表5。

表5 27批竹葉花椒樣品中黃酮成分含量Table 5 Contents of flavonoids in 27 batches of Z.armatum(mg/g，n = 3)

續(xù)表5(Continued Tab.5)

不同批次竹葉花椒總黃酮、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷的含量測定結(jié)果見表5，不同產(chǎn)地的總黃酮及4種黃酮類成分含量存在較大差異。其中，涼山鹽源(s3)竹葉花椒金絲桃苷、異槲皮苷含量最高，涼山布拖(s8)的4種黃酮類成分含量總量(TL)最低，由此可知，涼山州竹葉花椒黃酮含量差異較大。巴中平昌(s19)的蘆丁和槲皮苷含量最高，巴中通江(s12)總黃酮含量最高。樂山夾江(s14)的總黃酮含量最低，且4種黃酮類成分含量總量(TL)較低。

2.3 抗氧化活性測定

2.3.1 供試品溶液的制備

按照“2.1.2”項下的方式制備供試品原液，再分別制成濃度為0.004、0.02、0.04、0.08、0.16、0.32、0.48 mg/mL的溶液。

2.3.2 Vc溶液制備

精密稱取L-抗壞血酸(Vc)5.06 mg，置于10 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解，定容，搖勻，即得Vc原溶液濃度為0.506 mg/mL。再分別制成濃度為0.000 506、0.001 265、0.002 53、0.005 06、0.006 325、0.012 65、0.025 3 mg/mL。

2.3.3 DPPH溶液的配制

精密稱取DPPH 2.02 mg，置于50 mL容量瓶中，加95%乙醇溶解，定容，搖勻，即得DPPH溶液(濃度為0.040 4 mg/mL)。

2.3.4 ABTS溶液的配制[13]

將ABTS配制成6.94 mmol/L水溶液，將K2S2O8配制成2.6 mmol/L水溶液，在使用前將二者混合溶液置于陰涼處12～16 h，使兩者發(fā)生完全充分的反應(yīng)。然后用95%乙醇稀釋原溶液，在波長734 nm處檢測，直到最終測得的吸光度值在0.70±0.02之間，即完成ABTS+溶液的配制。

2.3.5 DPPH清除率計算

96孔板加入樣品后置于陰暗處反應(yīng)1 h后使用Varioskan Flash酶標(biāo)儀測定OD值，測定波長選擇517 nm。DPPH清除率計算公式如下：

式中：A0表示100 μL DPPH溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值；A1表示100 μL DPPH溶液+100 μL供試品/Vc溶液的吸光度值；A2表示100 μL供試品溶液溶液+100 μL 95%乙醇的吸光度值。

2.3.6 ABTS清除率計算

96孔板加入樣品后置于陰暗處反應(yīng)40 min后使用Varioskan Flash酶標(biāo)儀測定吸光度OD值，測定波長選擇750 nm。ABTS清除率計算公式如下：

式中：A0表示25 μL 95%乙醇+175 μL ABTS+的吸光度值；A1表示25 μL樣品+175 μL ABTS+的吸光度值；A2表示25 μL樣品175 μL 95%乙醇的吸光度值。

2.3.7 相關(guān)性分析

采用Graphpad prism 7.0軟件[18]，預(yù)測出EC50值，結(jié)果見表6。

由表6可知，不同產(chǎn)地花椒甲醇提取物對DPPH、ABTS自由基清除能力具有一定差異。其中，巴中通江(s12)對DPPH自由基的清除能力最高，綿陽三臺(s15)對ABTS自由基的清除能力最高，但清除率均低于對照組。

表6 DPPH和ABTS法測定的27批竹葉花椒的EC50值Table 6 EC50 of 27 batches of Z.armatum determined by DPPH and ABTS methods

皮爾遜相關(guān)系數(shù)被用于衡量2個變量之間的線性關(guān)系[19]，應(yīng)用IBM SPSS Statistics 23 軟件對27批不同產(chǎn)地竹葉花椒甲醇提取物中總黃酮、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷成分含量分別與DPPH自由基清除率的EC50值、ABTS自由基清除率的EC50值計算皮爾遜相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見表7，總黃酮和蘆丁與DPPH、ABTS自由基清除率的EC50值均呈顯著負(fù)相關(guān)性，表明總黃酮與蘆丁可作為評價竹葉花椒抗氧化能力的指標(biāo)之一。蘆丁含量與總黃酮含量相關(guān)系數(shù)較高(相關(guān)系數(shù)≥0.6)，存在較高一致性。

表7 黃酮類物質(zhì)與抗氧化性相關(guān)系數(shù)Table 7 Correlation coefficient between flavonoids and antioxidant activity

3 討論與結(jié)論

本研究采用HPLC法同時測定竹葉花椒中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、槲皮苷成分含量，采用分光光度計測定總黃酮含量，比較不同產(chǎn)地黃酮類成分含量差異。結(jié)果顯示，總黃酮含量范圍為30.460 7～90.173 1 mg/g，巴中市通江縣(s12)總黃酮含量是樂山市夾江縣(s14)總黃酮含量3倍，金絲桃苷含量范圍為0.442 7～3.983 2 mg/g,涼山州鹽源縣(s3)金絲桃苷含量超過涼山州布拖縣(s8)含量近10倍，涼山州鹽源縣(s3)四種黃酮類成分含量總和(TL)是布拖縣(s8)的5倍，不同產(chǎn)地的總黃酮及4種黃酮類成分含量存在較大差異。

采用DPPH、ABTS自由基清除法試驗，對21個產(chǎn)地的川產(chǎn)竹葉花椒的抗氧化活性進行分析，并采用皮爾遜雙變量相關(guān)分析對黃酮成分和抗氧化活性進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地竹葉花椒抗氧化活性存在較大差異。巴中通江(s12)對DPPH自由基的清除能力最高，相對其他地區(qū)，3批巴中竹葉花椒甲醇提取物對DPPH的清除能力均較高，與黃酮含量測定結(jié)果一致，但綿陽三臺對ABTS自由基的清除能力最好，表明不同體外抗氧化活性試驗結(jié)果存在差異。

相關(guān)性分析結(jié)果，蘆丁含量與總黃酮含量存在較高一致性，因此，竹葉花椒中蘆丁含量可作為總黃酮含量高低的評價指標(biāo)。總黃酮和蘆丁與DPPH、ABTS自由基清除率的EC50值呈顯著負(fù)相關(guān)，說明竹葉花椒中總黃酮、蘆丁抗氧化作用明顯，Zhang[20]比較了蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷、山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖四種單體化合物的抗氧化活性，活性順序為金絲桃苷>蘆丁>異槲皮苷，目前未見文獻報道槲皮苷的抗氧化活性，蘆丁和金絲桃苷含量占4種黃酮類成分含量總和的57.8%～67.3%，因此，蘆丁可作為評價竹葉花椒抗氧化活性的指標(biāo)之一。

在測定竹葉花椒黃酮類成分含量中，不同產(chǎn)地總黃酮、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮苷與槲皮苷含量存在明顯差異。查閱文獻發(fā)現(xiàn)，影響因素較多[21]，由于本實驗采集樣品產(chǎn)地較集中，有一定的局限性，進一步研究將收集全國不同省份竹葉花椒樣品，初步探索竹葉花椒抗氧化機制，為其大健康衍生品開發(fā)提供實驗依據(jù)。