皮蛋腌制液中銅離子快速檢測技術

張惠賢，崔文文，王明銳，姚晶晶，杜金平，孫 靜，張 昊

（湖北省農業科學院，a.農業質量標準與檢測技術研究所/農業農村部農產品質量安全風險評估實驗室/農產品營養品質與安全湖北省重點實驗室；b.畜牧獸醫研究所，武漢430064）

皮蛋，又稱松花蛋、變蛋、彩蛋等，是中國傳統風味蛋制品之一，具有營養豐富、色澤美觀、風味獨特、食用方便等優點［1，2］。在皮蛋腌制過程中，為了調控氫氧化鈉進入量，需要在腌制液中添加一些重金屬鹽以達到“堵孔”的目的，控制皮蛋的品質［3］。傳統的皮蛋加工工藝一般使用氧化鉛［4］，但是鉛會對人體健康造成危害，尤其會危害兒童的智力發育［5］。近年來，銅、鐵、鋅等重金屬被用來代替鉛［6，7］，“銅法”是實際工業化生產中應用最普遍的皮蛋生產無鉛化技術［8］。

銅是人體所必需元素之一，但是由于中國人群的特殊膳食結構，普遍不缺銅，皮蛋中過量的銅可能會導致“銅中毒”現象［9］，因此需要實時監控生產過程中腌制液中銅離子濃度，防止皮蛋中銅含量過多。皮蛋腌制液的配料主要組成為氫氧化鈉、氧化鈣、重金屬鹽、茶葉等［7］，基質成分復雜，鹽度和堿度高，對腌制液中Cu（Ⅱ）的快速、實時檢測非常困難，目前還未見文獻報道皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）檢測的方法。

目前，文獻報道了多種食品和環境中Cu（Ⅱ）的檢測方法，如分光光度法［10］、電化學分析法［11］、原子吸收光譜法［12］、電感耦合等離子體法［13］、電感耦合等離子體質譜法等［14］。其中，原子吸收光譜法、電感耦合等離子體法和電感耦合等離子體質譜法前處理繁瑣耗時、儀器昂貴，不適合Cu（Ⅱ）的快速檢測；電化學分析法不適合基質復雜體系［15］。相比于其他方法，分光光度法具有成本低、快速、準確、操作簡便等特點，被廣泛用于廢水、食品、礦物等樣品中的Cu（Ⅱ）的檢測［16-19］。顯色試劑雙環己酮草酰二腙（BCO）可以與Cu（Ⅱ）發生顯色反應生成穩定的藍色絡合物Cu（BCO）2［19］。因此，本研究以BCO為絡合試劑，運用分光光度法檢測皮蛋腌制液中的Cu（Ⅱ），實現復雜基質、高鹽體系中高含量Cu（Ⅱ）的快速測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器DU800型紫外-可見分光光度計（美國Backman公司）；ME104型電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-500B型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司）；PHS-3C型酸度計（上海精密科學儀器有限公司）；水浴鍋（北京市永光明醫療儀器廠）。

1.1.2 試劑雙環己酮草酰二腙（BCO）、硫酸銅、氨水、氯化銨、鹽酸、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、曲拉通X-100、十二烷基磺酸鈉（SDS）、N，N-二甲基甲酰胺（DMF）和乙醇等試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；所用水為去離子水。

BCO（DMF/乙醇=v/v∶1/1）溶液（6.0 g/L）的配制：稱取0.3 g（精確至0.000 1 g）BCO，加入DMF/乙醇（v/v∶1/1）溶液加熱溶解，冷卻至室溫后，定容至50 mL。

Cu（Ⅱ）儲備液（0.8 g/L）的配制：根據皮蛋腌制過程中使用硫酸銅的量，稱取0.3 g（精確至0.000 1 g）五水硫酸銅，利用不含硫酸銅的皮蛋腌制液溶解，定容至100 mL。

Cu（Ⅱ）工作溶液配置（16 mg/L）：準確移取儲備液1.00 mL，緩沖溶液定容至50 mL。

硼酸-硼砂、檸檬酸-氨水、硼酸-氫氧化鈉、氯化銨-氨水緩沖溶液在酸度計上混合至所需pH。

1.2 腌制液中銅離子絡合方法

由于皮蛋腌制液成分復雜，Cu（Ⅱ）可能會發生復雜的絡合反應，在加入絡合試劑BCO前，加入鹽酸破壞Cu（Ⅱ）的基底絡合態，釋放出Cu（Ⅱ）。準確移取2.0 mL皮蛋腌制液，加入2.0 mL 5.0 mol/L HCl溶液，振蕩均勻，放置20 min后，利用pH 9.0氯化銨-氨水緩沖溶液定容至100 mL。于25 mL比色管中，依次加入2.0 mL 6.0 g/L BCO儲備液、3.0 mL皮蛋腌制液稀釋液，用pH 9.0氯化銨-氨水緩沖溶液定容至25 mL后，渦旋搖勻，于30℃絡合反應40 min。

1.3 皮蛋腌制液中硫酸銅含量的測定

移取顯色溶液于1 cm比色皿中，以相應的參比溶液為參比，于分光光度計606 nm處測量吸光度，從校準曲線上查出相應的Cu（Ⅱ）的含量，按式（1）計算硫酸銅的質量分數。

式中，M(CuSO4)為皮蛋腌制液中硫酸銅的濃度，g/L；m為從校準曲線上查得的樣品顯色液中的Cu（Ⅱ）濃度，mg/L。

1.4 標準曲線的繪制

25 mL比色管中分別加入2 mL的6.0 g/L BCO溶液，加入不同量的Cu（Ⅱ）標準溶液，氯化銨-氨水緩沖溶液定容至25 mL，使其濃度分別為0、0.32、0.64、1.28、1.92和2.56 mg/L，反應完畢后分別測定其吸光度。

2 結果與分析

2.1 吸收波長的選擇

將絡合物Cu（BCO）2及空白皮蛋腌制液的吸收波長進行掃描，結果如圖1所示。絡合物Cu（BCO）2的最大吸收波長在606 nm處（a），皮蛋腌制液（b）和BCO（c）溶液基本無吸收。結果表明，BCO檢測皮蛋腌制液中的銅離子具有可行性，選擇檢測波長為606 nm，樣品基質及BCO在此波長下無干擾。

圖1 絡合物Cu（BCO）2（a）、皮蛋腌制液（b）和BCO（c）的吸收波長

2.2 絡合反應條件研究

2.2.1 緩沖體系及pH的選擇選取硼酸-硼砂、檸檬酸-氨水、硼酸-氫氧化鈉和氯化銨-氨水4種緩沖體系，根據緩沖溶液的緩沖范圍選取pH。如圖2A所示，絡合反應在硼酸-硼砂和硼酸-氫氧化鈉緩沖體系受pH影響較大，而在氯化銨-氨水緩沖體系的pH 8.0~10.0吸光度穩定，在檸檬酸-氨水緩沖體系的pH 9.0~10.0吸光度穩定，但吸光度低于氯化銨-氨水緩沖體系。故選擇氯化銨-氨水緩沖體系，絡合物Cu（BCO）2在pH 8.0~10.0吸光度是穩定的，為減少pH變化帶來的影響，選擇pH 9.0的氯化銨-氨水緩沖體系。

2.2.2 緩沖鹽用量分別考察了pH 9.0的氯化銨-氨水緩沖溶液（0.2 mol/L氯化銨-1.0 mol/L氨水）不同用量對BCO絡合Cu（Ⅱ）的影響，結果如圖2B所示。緩沖溶液用量對絡合反應無明顯影響，說明在該pH下，絡合物Cu（BCO）2較為穩定，為減少皮蛋腌制液對反應溶液pH的影響，采用pH 9.0的氯化銨-氨水緩沖溶液定容。

圖2 不同緩沖體系及pH（A）及緩沖鹽用量（B）對BCO絡合Cu（Ⅱ）的影響

2.2.3 反應溫度與反應時間絡合反應的效率與時間和溫度密切相關，圖3A是反應溫度和時間對BCO絡合Cu（Ⅱ）的影響，結果表明，反應溫度為30℃時，在40 min時吸光度最大，同時反應時間80 min時，吸光度僅下降了7.4%，表明絡合物Cu（BCO）2在該溫度下較為穩定。故選擇反應溫度為30℃，反應時間為40 min。

2.2.4 BCO用量影響根據實際皮蛋腌制液硫酸銅使用的最大濃度3.0 g/L，設置Cu（Ⅱ）濃度為1.2 mg/L，加入不同量的BCO 6.0 g/L（DMF/乙醇=1/1）溶液，使其濃度分別為0.048、0.096、0.144、0.192、0.240、0.300 g/L，考察BCO用量對顯色的影響。結果（圖3B）表明，當BCO的用量是Cu（Ⅱ）40倍以上時，其用量對顯色反應基本無影響，故選擇BCO用量為0.048 g/L。

圖3 反應時間和溫度（A，a：30℃；b：40℃；c：50℃）和BCO用量（B）對BCO絡合Cu（Ⅱ）的影響

2.2.5 離子掩蔽劑的影響鐵離子、鋁離子等元素會干擾Cu（Ⅱ）的測定，選擇加入檸檬酸三銨掩蔽鐵離子、鋁離子等離子的干擾，考察了檸檬酸三銨對絡合反應的影響。結果表明，由于皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）濃度遠遠大于干擾離子濃度，因此離子掩蔽劑對絡合反應影響不大。

2.3 體系穩定性

顯色劑及其絡合物的穩定性對樣品檢測非常重要，考察了Cu（BCO）2絡合物在150 min內的穩定性。如圖4所示，絡合物在室溫150 min內基本穩定，150 min時吸光度只下降約3.0%，對檢測無影響，滿足檢測要求。

圖4 室溫下絡合物Cu（BCO）2的穩定性

2.4 工作曲線、回收率及精密度

在最佳絡合條件下，考察了該方法的線性范圍、檢測限和重現性。吸光度與Cu（Ⅱ）的濃度在0~2.56 mg/L范圍內呈線性關系，線性方程為y=0.067 71x-0.011 57，其中，y為吸光度，x為Cu（Ⅱ）的濃度（mg/L），相關系數R2為0.999 5。

分別在不含Cu（Ⅱ）離子的皮蛋腌制液中添加硫酸銅，使其Cu（Ⅱ）最終濃度分別為0.12、0.24、0.48、0.72 g/L，按照最優的絡合反應條件進行絡合反應計算加標回收率，結果見表1。皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）的加標回收率在97.9%~103.4%，日內、日間標準偏差（RSD）低于3.17%，表明該方法具有良好的準確度和精密度。

表1 皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）的添加回收率和日內日間精密度（n=5）

2.5 實際樣品測定

抽取皮蛋加工廠的不同時期的皮蛋腌制液，根據優化好絡合反應條件測得其中Cu（Ⅱ）的含量，再根據式（1）計算其中硫酸銅的含量分別為2.78、1.23、2.07和1.01 g/L。

3 結論

本研究首次將雙環己酮草酰二腙（BCO）用于分光光度測定皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ），BCO與Cu（Ⅱ）的絡合物Cu（BCO）2最大收波長為606 nm，BCO及皮蛋腌制液在此波長下無吸收，極大地降低了來自皮蛋腌制液基底的背景干擾，使樣品前處理更為簡單。建立的皮蛋腌制液中Cu（Ⅱ）檢測方法具有方便、快速、直接、靈敏、省時和抗干擾能力強等優點。最后，將該方法用于皮蛋腌制液硫酸銅含量的準確測定，為皮蛋生產過程中硫酸銅含量的監測提供有力工具。