烏梅發酵香料工藝正交優化及其致香成分分析

何 力，羅海濤，劉思奎，鄒恩凱，任周營，邵燈寅，陳俊宇，羅建飛

（1.江西中煙工業有限責任公司，南昌330000；2.云南瑞升煙草技術（集團）有限公司，昆明650000）

烏梅，別名酸梅、黑莓，薔薇科植物梅的果實。烏梅喜溫暖濕潤、陽光充足的環境，耐寒、耐旱、不耐澇。據相關研究表明烏梅中含有蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸、谷甾醇、維生素和礦物質等多種成分［1，2］。烏梅被廣泛用于食品、藥品以及化工行業，是一種極具開發潛力的水果［3，4］。利用烏梅原料制作傳統香料的工藝已經很成熟，但是利用微生物進行烏梅原料發酵的研究還鮮有報道。微生物發酵方法不論從香味獨特性、成本控制、競爭力以及危廢處理上，都展現出了廣闊的市場前景［5］。傳統提取工藝無法將烏梅原料中纖維素、果膠等物質進行利用，而微生物的代謝活動能充分利用這些物質，并將其轉化成其他物質［6-8］，本研究利用從松樹林土壤中篩選出的一株真菌進行烏梅原料的發酵試驗，并對其致香成分進行分析，為微生物發酵香料研究提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

HP6890/5973 GC/MS分析儀，美國Agilent公司；SHZ-LII予華牌循環水真空泵，鞏義市予華儀器有限責任公司；LABOROA 4000旋轉蒸發儀，Heido?lph；PL3002電子精密天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；SW-CJ-1D單人凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司；DW-86L388J醫用低溫保存箱，青島海爾生物醫療股份有限公司。

1.2 材料與試劑

烏梅原料（自制）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA），廣東環凱微生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖水，廣東環凱微生物科技有限公司；LB培養基，青島海博生物科技有限公司；TSA培養基，青島海博生物科技有限公司；丙三醇AR，西隴化工股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選從云南昆明當地松樹林中采集離地表10 cm深處的土壤10 g［9］，放入已滅菌的蒸餾水中，搖床搖晃1 h±10 min，使土壤中自然存在的菌種充分脫落，然后利用滅菌紗布過濾土壤，之后取其搖晃充分的液體進行稀釋涂布平板法接種，接種結束后，PDA平板放于28℃恒溫培養箱中培養5~7 d，TSA平板放于37℃恒溫培養箱培養24~48 h。培養結束后，觀察長有單菌落的平板，將不同菌落形態的單菌落挑入液體培養基中，PDA平板的單菌落挑入馬鈴薯糖水培養基中培養3~5 d，TSA平板的菌落挑入LB液體培養基中培養24~48 h，無單菌落平板不進行菌種挑選，培養結束后，進行平板劃線純化菌株，之后保種于-80℃低溫冰箱中。從土壤中篩選出真菌3株，選用其培養液氣息較好的一株真菌進行發酵試驗，該真菌在PDA平板上蔓延性生長，能清晰地看見菌絲體，呈青色，表面附著有孢子，在培養3 d后開始出現肉眼可見的菌體，5 d后形成孢子。將其孢子接種進馬鈴薯糖水進行搖床培養，24 h后培養基可變渾濁，48~72 h后可在培養基中形成菌絲球［10］。

1.3.2 菌株分子生物學鑒定方法將獲得的菌液，經過液氮冷凍后，取2 g放入研缽中進行研磨，研成粉末狀后加入DNA提取液（0.2 mol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、0.01 mol/L EDTA、1%SDS），添加比例為每0.1 g粉末加入2 mL提取液，然后加入與提取液等體積的酚-氯仿-異戊醇混合液（體積比為25∶24∶1），于渦旋器上劇烈渦旋5 min，然后置于冷凍離心機內以8 000 r/min、4℃離心5 min，將上清液轉移到一個新離心管中，向該離心管中加入300 mL的無水乙醇置于-20℃放置30 min。之后取出離心管，以10 000 r/min、4℃離心10 min，棄上清液，在空氣中放置10 min使乙醇揮發完全。加入2 mL的TE溶液（10 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA）溶解沉淀即得到基因組DNA。之后將提取獲得的DNA進行PCR擴增，引物對為ITS1，然后將得到的PCR產物進行切膠純化后進行測序獲得其結果。

1.3.3 正交試驗設計利用Penicillium polonicum真菌進行烏梅原料發酵的單因素設計試驗，以及根據微生物發酵在其他底物上的應用［11，12］，以發酵時間、發酵溫度和菌液接種量為主要影響因素，感官評吸分數作為考察指標，進行L9（34）正交試驗，每項試驗重復3次。

1.3.4 菌株發酵試驗種子液的制備：取出保存菌株，接種于馬鈴薯糖水培養基中，接種量為菌種保存液∶培養基=1∶100，接種后于搖床中28℃，180 r/min培養72 h后取出備用。

底物制備：取烏梅去核果肉100 g于錐形瓶中，補水至400 g后放入高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min，結束后拿出冷卻到常溫備用。

發酵濃縮試驗：在無菌環境下，取已制備好的種子液，接種于冷卻至常溫制備好的底物中，接種后充分搖晃后，放于搖床中培養。培養結束后取出發酵液，裝入旋轉蒸發儀中進行濃縮，水浴溫度為70℃，烏梅發酵浸膏濃縮至密度為（1.390±0.008）g/cm3。

1.3.5 樣品致香成分檢測方法將制得的發酵烏梅浸膏與未發酵的烏梅原料，利用同時蒸餾萃取-氣相色譜質譜聯用法檢測其致香成分并進行結果分析。

同時蒸餾萃取：取發酵樣品與未發酵原料各25 g放入同時蒸餾萃取裝置一端的500 mL圓底燒瓶中，加入250 g水，用電熱套加熱，裝置的另一端為盛有25 mL二氯甲烷的100 mL圓底燒瓶，用60℃水浴加熱，同時蒸餾萃取2 h。二氯甲烷萃取液用無水硫酸鈉干燥，置于4℃保藏柜放置，過濾，濾液倒入濃縮瓶中用Vigreux柱濃縮至約1 mL，濃縮液用于GC/MS分析備用。

GC/MS條件：毛細管柱HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進樣口溫度240℃；載氣He，1 mL/min；程序升溫50℃（1 min）→8℃/min→160℃（2 min）→8℃/min→260℃（15 min）；進樣量1 μL，分流比20∶1；傳輸線溫度280℃；電離方式EI，電離能量70 eV；離子源溫度230℃；四級桿溫度160℃；質量范圍35~455 aum，溶劑延遲時間2 min。

2 結果與分析

2.1 菌株鑒定結果

根據堿基對分析得到以下結果，見圖1。通過測序結果對比查詢可知，該菌株為Penicillium polon?icum真菌，有相關研究表明該真菌的代謝產物在各領域中有較多的應用［13-15］。且劉靜等［15］在利用其PDB培養基進行培養后，得到了酯類、烯烴類、醛類以及雜環類物質。

2.2 工藝優化

經前期單因素試驗驗證，將發酵時間、發酵溫度以及接種量作為主要影響因素，制作正交因素水平表L9（34）（表1），利用SPSS軟件進行正交試驗設計對發酵工藝進行優化。

表1 正交試驗因素水平表L9（34）

2.2.1 正交試驗結果直觀分析根據正交設計直觀結果（表2）和極差值R的結果（表3）可以得出，各因素對感官評吸分數影響大小的順序為發酵時間（A）＞發酵溫度（B）＞接種量（C）。

表2 正交試驗結果

表3 各因素水平均值與極差

根據3因素的平均值以及水平均值（圖2）分析可以得出，發酵溫度為25℃，感官評吸分數最高；發酵時間為24 h，感官評吸分數最高；接種量為2%，感官評吸分數最高。因此得出其最佳的組合方式為A1B1C2，即發酵烏梅原料的條件為溫度25℃、發酵24 h、接種量2%。

圖2 三因素三水平均值

2.2.2 正交試驗結果的方差分析和多重比較方差分析結果（表4）表明，各因素對發酵烏梅原料的感官評吸結果的影響為發酵時間影響顯著（P＜0.05），發酵溫度影響顯著（P＜0.05），接種量影響不顯著（P＞0.05）。

表4 L9（34）正交試驗方差分析

多重因素比較結果（表5至表7）表明，發酵時間中24、48 h水平之間差異不顯著（P＞0.05），發酵溫度中25、30℃之間差異不顯著（P＞0.05），接種量各水平之間差異不顯著（P＞0.05），因此，可以確定其最適合發酵條件為A1B1C2，即發酵時間24 h，發酵溫度25℃，接種量2%。

表5 因素A多重比較（LSD法）

表7 因素C多重比較（LSD法）

2.3 致香成分分析

利用正交試驗所得結果進行發酵后烏梅提取物與未發酵烏梅原料的致香成分進行分析，利用同時蒸餾萃取-氣相色譜質譜聯用法得到以下致香成分，結果見表8。

表6 因素B多重比較（LSD法）

發酵烏梅提取物與未發酵烏梅原料致香成分分析可以發現，發酵烏梅浸膏中在應用方面有正面作用的苯甲醇、苯乙醇、苯乙醛［16，17］的含量明顯增加，并且產生了新的揮發性物質，其中3-戊烯-2-酮、己醛、乙酸丁酯、2-甲基丁酸、乙酰乙酸乙酯都帶有果香味，可以豐富烏梅發酵浸膏果類香味。此外，發酵后的浸膏中具有抑制香氣作用的戊酸、己酸、苯甲酸、癸酸乙酯［18］的含量下降。

由表8可知，發酵的烏梅原料中酸類有12種，醛類5種，酯類24種，酮類13種，醇類6種，酚類4種，烯烴類1種，雜環類11種，共76種物質，其主要為糠醛（94.192 μg/g）、苯甲酸（34.948 μg/g）、棕櫚酸（155.395 μg/g）、棕櫚酸乙酯（69.033 μg/g）、亞油酸（38.596 μg/g）、亞油酸乙酯（54.879 μg/g）、亞麻酸乙酯（35.929 μg/g）。發酵24 h烏梅提取物中酸類有8種，醛類8種，酯類23種，酮類16種，醇類2種，酚類4種，烯烴類1種，雜環類7種，共68種致香物質，有9種新增物質，發酵提取物揮發性成分主要為苯甲醇（34.035 μg/g）、苯甲酸（30.113 μg/g）、棕櫚酸（111.236 μg/g）、棕櫚酸乙酯（38.695 μg/g）、亞油酸（34.555 μg/g）、亞油酸乙酯（32.446 μg/g）。發酵48 h烏梅提取物中酸類有8種，醛類8種，酯類22種，酮類17種，醇類2種，酚類5種，烯烴類1種，雜環類7種，共70種，有11種新增物質，發酵提取物揮發性成分為苯甲醇（33.397 μg/g）、棕櫚酸（76.872 μg/g）、棕櫚酸乙酯（31.954 μg/g）。

表8 未發酵烏梅浸膏與發酵烏梅浸膏致香成分

續表

從圖3和圖4分析可得，發酵24h烏梅提取物與未發酵烏梅原料相比，致香物質中糠醛含量下降79.03%，戊酸下降100%，己酸下降86.21%，正己酸己酯下降100%，苯甲酸下降13.83%，松油醇下降100%，十五酸下降27.70%，棕櫚酸乙酯下降43.95%，亞油酸下降10.47%，亞油酸乙酯下降40.88%，亞麻酸乙酯下降34.21%；而也有一些含量明顯增加的物質，如3-甲基丁醛上升37.94%，苯甲醇上升89.99%，苯乙醛上升102.19%，4-烯丙基苯酚上升80%，二氫獼猴桃內酯上升35.77%。發酵48 h烏梅提取物與未發酵烏梅原料相比，糠醛含量下降79.47%，戊酸下降100%，己酸下降84.60%，正己酸己酯下降100%，苯甲酸下降45.85%，松油醇下降100%，十五酸下降28.04%，棕櫚酸乙酯下降53.71%，亞油酸下降49.57%，亞油酸乙酯下降52.47%，亞麻酸乙酯下降48.88%；而也有一些含量明顯增加的物質，如3-甲基丁醛上升45.23%，苯甲醇上升86.43%，苯乙醛上升109.72%，4-烯丙基苯酚上升51.72%，二氫獼猴桃內酯上升14.04%。綜上，利用Penicillium polonicum真菌進行烏梅原料發酵，能提高致香物質中果香類物質的含量，降低抑制香氣物質的含量。在發酵過程中部分致香物質發酵24 h后含量上升，但發酵48 h后，開始下降，這是因為微生物代謝活動所產生的代謝產物的過多積累會影響菌株的生長，當代謝產物積累到一定量時，菌株代謝活動將被抑制，甚至會利用代謝產物重新合成其他的物質［19］。

圖3 致香成分分析

圖4 致香成分分析

3 結論

本試驗利用從松樹林土壤中篩選出來的Peni?cillium polonicum真菌菌株，在烏梅原料上進行發酵，發酵后物質含量和數量有明顯改變，苯甲醇、苯乙醛和3-甲基丁醛的含量有明顯的上升，并且新增了己醛、2-甲基丁酸、異麥芽酚等物質，它們都能為浸膏帶來強烈的果香味。從數據上可以推論Peni?

cillium polonicum真菌主要是利用浸膏中的糠醛和有機酸類物質進行自身的代謝活動，而產生其他的醇類、酚類、醛類與雜環類物質，由于雜環類物質有不飽和的閉環體系，因此性質穩定，且與苯系物有著相似的性質［20，21］，醇、酚、醛以及苯系物大部分具有豐富香氣的作用，對發酵的烏梅提取物的致香成分積累有著重要的作用。而且從發酵時間上來看，發酵24 h的提取物積累的致香物質總量相對較多，發酵后的樣品能帶來更好的清甜香氣，說明該菌株以烏梅為原料進行發酵時，發酵24 h時效果達到最佳。