羊流產嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網絡的構建

劉 威，袁芳艷，周丹娜，劉澤文，高 婷，郭 銳，楊克禮，段正贏，梁 婉，田永祥

（湖北省農業科學院畜牧獸醫研究所/農業農村部獸用藥物與診斷技術湖北科學觀測實驗站，武漢430064）

羊流產嗜性衣原體（Chlamydia abortus）為專性細胞內寄生的革蘭氏陰性菌，是一種重要的人畜共患傳染病病原，屬于衣原體科（Chlamydiaceae）衣原體屬（Chlamydia），能引起豬、牛、羊等多種動物流產、死胎、產弱仔等［1］。流產衣原體為世界動物衛生組織（Office international desépizooties，OIE）規定的二類動物疾病，該病廣泛分布于世界各地［2］，對畜牧業造成巨大的經濟損失，孕婦感染也可發生流產［3］，其診斷和防治制劑的研究具有十分重要的公共衛生及經濟意義［4］。

流產衣原體主要寄生于牛、羊、豬等多種動物生殖道黏膜表面的上皮細胞內［5］。不同年齡段的羊都可感染且臨床表現不同：新生羔羊主要以關節炎、腦炎癥狀為主；公羊主要以睪丸炎癥狀為主；母羊主要發生妊娠后期流產、產死胎、弱胎等［6］。母羊在流產后會獲得免疫保護，但其仍成為衣原體的攜帶者，會在發情期將大量的原生小體（EB）排出體外，成為新的傳染源［7］。疫苗接種是預防衣原體感染的有效措施，然而由于雞胚生產疫苗的工藝復雜、耗時費力、成本高等原因，中國市場上還沒有商品化的羊衣原體疫苗。臨床上一般采用抗生素治療該病，但容易產生耐藥性，引起持續、慢性、亞臨床感染［8］。長期使用抗生素對羊地方性流產（Ovine enzootic abor?tion，OEA）進行防治并不是一個理想的方法，也不符合當前“減抗限抗”的政策要求。利用現代生物信息學和分子生物學技術尋找羊流產嗜性衣原體新的藥物靶標，將為OEA的防控、新型藥物的研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 基因組序列與數據庫

羊流產嗜性衣原體標準菌株S26/3的全基因組序列來源于NCBI數據庫，氨基酸序列通過Artemis導出。直系同源分析時涉及到的數據來源于Database of Interaction Protein（DIP）數據庫。

1.2 方法

1.2.1 同源蛋白映射DIP數據庫中蛋白與蛋白間的互作關系已經通過酵母雙雜交、免疫共沉淀等方法證實。同源蛋白映射（HPM）是通過整合試驗中已確定的蛋白-蛋白相互作用信息，來預測未知蛋白間的互作網絡［9］。圖1展示了同源蛋白映射的原理。例如DIP數據庫中C與D能發生互作，而蛋白A與C同源，B與D同源，那么A和B極可能發生相互作用。基于此通過HPM構筑蛋白-蛋白相互作用網絡。

圖1 同源蛋白映射方法的原理

1.2.2 相互作用網絡的構建DIP數據庫中的氨基酸序列從DIP網站上下載獲得。Blast軟件包和羊流產嗜性衣原體的基因組序列從NCBI FTP服務器下載［10］。利用Formatdb將羊流產嗜性衣原體的氨基酸序列建庫，DIP數據庫中的氨基酸序列與羊流產嗜性衣原體氨基酸序列的同源性通過Blastp確定（E-value 1e-30）。Blastp得到的初步比對結果通過Script程序映射成互作網絡，以獲得最終的牛支原體蛋白-蛋白相互作用網絡。蛋白-蛋白相互作用網絡通過可視化軟件Cytoscape［11］展示。

表1 本研究中涉及的軟件與數據庫

2 結果與分析

2.1 羊流產嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網絡

通過同源蛋白映射的方法構建羊流產嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網絡。如圖2所示，預測的蛋白互作網絡中包含220個蛋白和1 276個相互作用關系，蛋白用圓形的節點表示，相互作用關系用藍色的直線表示。

圖2 羊流產嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網絡

2.2 蛋白相互作用發生頻率的分析

在蛋白-蛋白相互作用網絡中，互作頻率表示某單一蛋白與其他蛋白發生相互作用的數量。互作頻率較高的蛋白往往參與細胞的多種生命活動，在細胞的生存中起著十分關鍵的作用。表2列出了互作頻率最高的20個蛋白，大多數蛋白與轉錄、翻譯、分子伴侶等功能相關。CAB_RS01240、CAB_RS03155和CAB_RS01655分別編碼伴侶蛋白DnaK、GroEL和DnaJ，這幾個蛋白的互作頻率較高，且都能與核酸代謝蛋白（如UMP kinase等）、核糖體結構相關蛋白（如CAB_RS00255等）、DNA復制與修復相關蛋白（如CAB_RS00140，CAB_RS02555等）、熱休克蛋白（如CAB_RS03085等）發生相互作用。若DnaK、Gro?EL和DnaJ的功能受到抑制，將嚴重影響羊流產衣原體的生存和繁殖，結果提示DnaK、GroEL和DnaJ可以作為新型藥物的潛在靶標。

表2 相互作用網絡中互作頻率較高的20個蛋白

2.3 蛋白相互作用網絡中不同功能蛋白的分布

蛋白質直系同源簇（COGs）數據庫是對細菌、藻類和真核生物的21個完整基因組的編碼蛋白，根據系統進化關系分類構建而成。COGs庫常用于未知蛋白的功能預測和蛋白功能的分類研究中。對羊流產嗜性衣原體蛋白相互作用網絡中互作頻率高于10次的蛋白進行了功能分布分析，首先將互作頻率高于10次的蛋白根據蛋白質直系同源簇（COGs）數據庫進行功能分類，隨后對不同COGs功能類別的蛋白個數進行統計分析，結果如圖3所示。互作頻率較高的功能蛋白主要與DNA復制、核糖體結構、翻譯、分子伴侶和防衛機制等功能相關。DnaK、DnaJ和GroEL均為HSP家族，與ClpB形成多分子伴侶系統。該系統可穩定蛋白質結構，防止蛋白質凝聚、變性，并具有修復變性蛋白的能力，參與多種細胞進程［12］。CAB_RS00140編碼DNA拓撲異構酶，拓撲異構酶是生物體內的基礎酶類，參與到所有涉及DNA拓撲結構變化的生命活動中，如DNA的復制，轉錄和重組。核糖體是細胞內一種核糖核蛋白顆粒，由RNA和蛋白質構成，其惟一功能是按照mRNA的指令將氨基酸合成蛋白質多肽鏈，是細胞內蛋白質合成的分子機器。UMP/CMP激酶通過催化UMP、CMP和dCMP轉化為二磷酸形式，為核酸合成提供前體方面發揮著至關重要的作用［13］。上述蛋白在維持細胞正常的生命活動中都起著十分關鍵的作用，若這些蛋白的功能受到抑制將嚴重影響羊流產嗜性衣原體的生存與繁殖。

圖3 羊流產嗜性衣原體蛋白相互作用網絡中不同功能蛋白的分布

3 小結與討論

病原菌互作蛋白組學分析是解析致病相關信號通路和挖掘潛在藥物靶標的重要工具［9］。本研究通過HPM的方法構建了羊流產嗜性衣原體的蛋白-蛋白相互作用網絡，所構建的互作網絡包括220個蛋白和1 276個相互作用關系。HPM方法主要通過同源蛋白映射證實的互作關系，推斷功能未知蛋白之間的互作。為了減少假陽性的發生，在構建互作網絡時，通過結合序列覆蓋率和E-value［14］值綜合評價單一蛋白和互作關系的準確性，以確定最終的蛋白互作網絡。

在蛋白-蛋白相互作用網絡中，蛋白發生互作的頻率越高提示該蛋白在病原菌生命活動中越重要。在完成了牛支原體蛋白互作網絡的構建后，通過COGs對互作頻率最高的20個蛋白進行了功能分類。在這20個蛋白中，大多數蛋白與核糖體、DNA復制與修復、分子伴侶、轉錄與翻譯等功能相關。分子伴侶和核糖體蛋白往往在細胞的生命活動中起著關鍵的作用，例如伴侶蛋白能幫助蛋白正確折疊和降解，對細胞內病原菌抵抗宿主細胞的環境壓力十分重要。在羊流產嗜性衣原體蛋白互作網絡中，DnaK、DnaJ和GroEL發生互作的頻率較高，能與核糖體蛋白、DNA復制與修復、核酸代謝等多種蛋白發生相互作用。一旦DnaK、DnaJ和GroEL的功能受到抑制，將會對羊流產嗜性衣原體的正常生命活動造成不小的影響。

本研究通過HPM的方法構建了羊流產嗜性衣原體蛋白-蛋白相互作用網絡，蛋白互作網絡的構建將為新型藥物靶標的尋找、新的信號分子的篩選提供依據。