碳角屬真菌Xylaria sp.NH1801中除草活性化合物研究

劉 芳，王月瑩，張志剛，吳兆圓，張亞妮，方 偉

（湖北省生物農藥工程研究中心，武漢430064）

微生物是自然界的天然產物寶庫，其代謝產物結構種類十分豐富，在已商業化的除草劑產品中，有很多母體結構來自微生物代謝產物。細胞松弛素是由聚酮合成酶和氨基酸合成酶共同作用形成的大環含氮雜環類的化合物，這類化合物結構多樣，現已經分離得到數百個類似化合物，具有多種藥理活性，如抗炎、抗腫瘤、抗病毒和抗菌等［1］。隨著研究的不斷深入，發現細胞松弛素類化合物具有植物毒性，可以抑制植物生長。球毛殼菌素類化合物如球毛殼菌素A、C、V、E、F、Fex、K和O等化合物具有抑制小麥胚芽生長［2］，抑制苜蓿種子發芽［3］，抑制水芹菜種子［4］和蘿卜種子萌發［5］作用。另一類細胞松弛素類化合物細胞松弛素E對蘿卜種子根生長抑制活性IC50達1.57 μmol/L，細胞松弛素Z16對小麥種子根生長抑制活性IC50達17.35 μmol/L，而對蘿卜種子沒有影響［6］。在篩選具有除草活性資源時，得到1株碳角菌屬真菌Xylariasp.NH1801，其發酵提取物具有顯著抑制植物種子萌發的作用，對其進行活性成分跟蹤分離，得到1個細胞松弛素及其水解產物，并對2個化合物抑制稗草［Echinochloa crusgalli（L.）Beauv］和反枝莧（Amaranthus retroflexusL.）種子萌發作用進行評價。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑Bruker AVANCE（500 MHz）核磁共振儀（TMS為內標，δ為mol/mL）（德國Bruker?BioSpin公司）；Waters 2695液質聯用儀（美國Waters公司）；100~200目柱色譜填料柱層析硅膠（青島海洋化工廠）。化合物2，4-D（阿拉丁試劑有限公司）。試劑石油醚、乙酸乙酯、吐溫-80、葡萄糖均為國藥集團生產。培養所用馬鈴薯和大米均采購于市場。

1.1.2 試驗材料發酵菌種從湖北省武漢市郊區土壤中分離純化獲得，通過形態鑒定和ITS序列比對，該菌種鑒定為Xylariasp.，命名為Xylariasp.NH1801，該菌株已于2020年11月13日送至中國典型培養物保藏中心保存，保藏編號為CCTCC NO：M2020734。稗草和反枝莧種子均采購于市場。

1.2 方法

1.2.1 培養基的配制馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L，自然pH；大米培養基：大米80 g，水100 mL，放入500 mL培養瓶中，121℃滅菌后備用。

1.2.2 種子液的制備將斜面菌種Xylariasp.NH1801接種于茄形瓶中（PDA培養基），28℃恒溫培養7 d，用含0.1%吐溫-80的無菌水將孢子洗下，配制成濃度為1.0×107個孢子/mL的菌懸液，備用。

1.2.3 發酵培養按3%的接種量將菌懸液接入到大米培養基中（共接種5瓶培養基，大米用量400 g），28℃、靜置培養8 d。

1.2.4 提取分離在發酵瓶中加入等體積的乙酸乙酯，振蕩提取1 h，取上清液。回收乙酸乙酯溶劑得到乙酸乙酯提取物。加入少量甲醇溶解乙酸乙酯提取物，上硅膠柱（100~200目，青島海洋化工）。依次用石油醚∶乙酸乙酯（5∶1，3∶1，2∶1，1∶1）洗脫，收集石油醚∶乙酸乙酯2∶1洗脫部分，合并，回收溶劑，用甲醇溶解后，結晶，得到化合物1（200 mg）。

1.2.5 化合物1的水解將化合物1（50 mg）溶解于K2CO3溶液中，室溫攪拌6 h，用等體積乙酸乙酯萃取2次，合并乙酸乙酯，水洗至中性，回收乙酸乙酯，重結晶，得到化合物2（40 mg）。

1.2.6 種子萌發抑制試驗分別稱取化合物1、化合物2和除草劑2，4-D，用甲醇溶解成1 mg/mL。然后依次用甲醇化合物稀釋成200.0、100.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL。將各個濃度的試藥加入12孔板中，每孔200 μL，每個濃度3個復孔，空白對照加入相同劑量的純甲醇，揮干甲醇備用。將種子用流水沖洗4 h后，用高錳酸鉀溶液消毒15 min，無菌水沖洗干凈，晾干，每孔加入4粒種子，然后加入無菌水200 μL，28℃恒溫培養箱中放置48 h后觀察結果。用游標卡尺測量每粒種子發芽后的莖與根的長度，按以下公式計算藥物對種子萌發的抑制率。

抑制率=（空白長度-樣品長度）×100%/空白長度

2 結果與分析

2.1 化合物的結構鑒定

化合物1：白色結晶，ESI（M+）：524；13C NMR（100 MHz，MeOD）δ 216.71，176.72，171.92，138.18，132.99，132.29，131.04，129.66，127.92，77.91，73.96，64.07，60.99，58.83，56.49，55.98，54.33，51.16，46.00，45.75，42.76，38.85，37.75，22.18，20.38，19.56，19.46，12.36。結合文獻報道［7］數據鑒定化合物為19，20-環氧-細胞松弛素Q（19，20-epoxy-cytochalasin Q）（圖1）。

化合物2：白色結晶，ESI（M+）：482；13C NMR（100 MHz，MeOD）δ 216.95，178.49，138.21，132.55，132.43，131.14，129.67，128.05，78.11，73.18，64.65，60.97，59.23，57.38，56.21，55.65，52.29，45.53，44.75，42.98，38.84，37.95，22.35，19.79，19.45，12.62。結合文獻報道數據［7］鑒定化合物為21-去乙酰基-19，20-環氧-細胞松弛素Q（21-deacetyl-19，20-epoxycytochalasin Q）（圖1）。

圖1 化合物1和化合物2的結構式

2.2 化合物抑制稗草種子萌發效果

化合物抑制稗草種子萌發的試驗結果見表1。由表1可知，化合物1和化合物2均具有顯著抑制稗草種子萌發的活性，在最高濃度為200 μg/mL時，根長抑制率分別為83.3%和80.7%，莖長抑制率分別為80.4%和79.4%，對莖長抑制率與陽性對照除草劑2，4-D（78.8%）相當。化合物1和化合物2對稗草種子根的生長抑制作用強于對莖的生長抑制，在低濃度50 μg/mL時，化合物1和化合物2對根長抑制率分別為65.7%和60.7%，強于對莖長的抑制（分別為37.5%和34.5%），但是化合物1和化合物2對稗草根長的抑制均弱于除草劑2，4-D。

表1 化合物對稗草種子萌發的抑制率 （單位：%）

2.3 化合物抑制反枝莧種子萌發效果

化合物抑制反枝莧種子萌發試驗結果見表2。化合物1和化合物2均具有明顯抑制反枝莧種子萌發的活性，在200 μg/mL濃度時，化合物1和化合物2可以完全抑制種子萌發，抑制率達100%，強于對照藥物除草劑2，4-D（抑制率87.1%）。在低濃度50 μg/mL時，化合物1和化合物2也具有顯著的抑制活性，對種子萌發的抑制率分別為77.2%和75.4%，與對照藥物活性相當（抑制率為79.8%）。但是在更低濃度時，化合物1和化合物2的活性弱于陽性對照藥物2，4-D。

表2 化合物對反枝莧種子萌發的抑制率（單位：%）

3 討論

隨著除草劑的大量長期應用，不僅給環境帶來巨大的壓力，同時由于雜草的不斷生存進化，抗性雜草種類不斷增多，抗性不斷增強，不斷研發新型除草劑顯得仍然十分迫切。細胞松弛素是由微生物代謝產生的一類雜環化合物，其結構變化多樣，這也導致其活性的不同。球毛殼菌素類顯示對蘿卜種子萌發具有抑制作用，化合物結構中17位和21位對其活性較為關鍵［5］，化合物1和化合物2活性結果表明這一類化合物21位的乙酰化對活性沒有顯著影響。球毛殼菌素類化合物均沒有顯示劑量依賴作用，這一點與本試驗中2，4-D針對反枝莧效果類似［5］。另一類細胞松弛素類化合物細胞松弛素K和細胞松弛素E可以顯著抑制蘿卜種子萌發，并對根生長的抑制作用要強于莖，這與本研究中化合物對稗草的作用類似；在較低濃度時，細胞松弛素Z16和細胞松弛素K對蘿卜種子有較弱的促進生長作用［6］。細胞松弛素類化合物具有廣泛的除草活性，且結構與活性可變性較強，有望成為除草劑的先導化合物或者微生物類的生物除草劑。