菜薹尾菜原位還田對下季土壤微生物功能多樣性的影響

徐大兵，謝媛圓，佀國涵，袁家富，趙書軍

（農業農村部廢棄物肥料化利用重點實驗室/湖北省農業科學院植保土肥研究所，武漢430064）

近年來，中國蔬菜種植面積和產量逐年增加，2016年播種面積達2 232.8萬hm2，總產量7.98億t，其中湖北省總產量達4 002萬t，占全國蔬菜總產量的5.04%［1］。隨著蔬菜產量的增加，尾菜處理問題逐漸凸顯出來。2016年中國尾菜量近2.92億t［2］，其中湖北省尾菜量146萬t，可資源化利用尾菜117萬t，氮磷鉀養分儲量為氮（N）5.20萬t、磷（P2O5）2.91萬t、鉀（K2O）4.46萬t，數量巨大，因此，如何合理利用尾菜資源是目前湖北省乃至全國亟待解決的問題［3，4］。

與堆肥或簡易堆漚或沼氣等方式處理尾菜相比，原位還田成本較低［5，6］。蔬菜尾菜具有較低C/N值（平均11.04）和較高的含氮量（平均3.45%），易被微生物分解和礦化［2］。胡國平等［7］研究發現尾菜還田可以降低土壤硝態氮的淋失。相比尾菜堆肥化過程的研究，原位還田后對土壤環境的影響研究相對較少［8］。因此，在尾菜量逐年劇增的大背景下，人們對原位還田技術也會越來越關注，特別是對下季作物生長和土壤環境的影響，需要相關領域的學者進行深入長期的觀察研究。因此，本研究以紅菜薹尾菜為原料，研究紅菜薹尾菜原位還田后對下季四季豆種植土壤活性碳氮和微生物碳源利用能力的影響，以期為紅菜薹尾菜原位還田對土壤環境的影響提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗地位于湖北省武漢市蔡甸區永安鎮高新村（東經113°57′16.96″，北緯30°25′23.66″），是以壟崗為主體的丘陵性湖沼平原，屬北亞熱帶季風性氣候，年平均氣溫為17.1℃，年降水量為1 302.4 mm，日照為1 639.3 h。

1.2 材料

1.2.1 供試土壤供試土壤類型為潮土，0~20 cm土層基本理化性質：pH 6.70，有機質27.6 g/kg，堿解氮134.5 mg/kg，速效磷34.6 mg/kg，速效鉀167.5 mg/kg。

1.2.2 供試作物供試作物為四季豆，品種為架豆。

1.3 試驗設計

試驗于2018年4—6月進行，設置3個處理，處理1，不還田，常規施肥，75 kg復合肥（15-15-15），計作CK；處理2，菜薹全部還田，計作FS；處理3，菜薹全部還田+在常規施肥的基礎上化肥減施30%，計作FS-30N。各處理具體施肥量見表1，尾菜和70%復合肥作基肥，30%復合肥于開花結果時穴施追肥。洪山菜薹新鮮資源量50 250 kg/hm2，含水量89.53%，干物質量5 261 kg/hm2，氮、磷、鉀養分含量分別為2.81%、0.42%和4.37%。

表1 不同處理施肥量 （單位：kg/hm2）

每個處理重復3次，隨機區組排列。小區面積為4 m×10 m=40 m2。菜薹收獲后，采取旋耕的方式還田。在還田旋耕前施750 kg/hm2生石灰消毒殺菌。

1.4 樣品采集與測定

尾菜還田后分別于10、20、30、45、60 d采集0~20 cm土層新鮮土壤樣品，一部分用于Biology和硝態氮分析；一部分風干后用于活性有機碳分析。

1.4.1 硝態氮測定250 mL三角瓶中加入10.0 g新鮮土壤，加入50 mL 2 mol/L氯化鉀溶液，25℃振蕩30 min，定量濾紙過濾后濾液備用，取2 mL濾液去離子水定容至50 mL，625 nm和220 nm或275nm波長下比色測定，計算硝態氮含量。

1.4.2 土壤活性有機碳測定采用重鉻酸鉀外加熱法，稱取風干土0.10 g左右，加入10 mL 0.2 mol/L（1/6 K2Cr2O7-1/3 H2SO4，水∶酸=3∶1）混合液，130~140℃烘箱內共煮5 min，用標準0.05 mol/L FeSO4滴至磚紅色。

1.4.3 Biology測定無菌操作稱取10 g新鮮土置于100 mL滅菌生理鹽水中，150 r/min振蕩機振蕩15 min。吸取1 mL稀釋液加入9 mL無菌緩沖液的試管中，配制成10-2的稀釋液，同此法配制成10-3的稀釋液。將10-3的稀釋液倒入滅菌的V型槽中，用8通道加樣器向BIOLOG孔板各孔中分別添加150 μL稀釋后的懸液。每個土壤樣品3次重復。25℃恒溫培養，在24、48、72、96、120、144、168 h后使用BIOLOG EMAX讀板儀讀取各孔在590 nm處的吸光度［9］。

1.5 數據分析

本研究采用平均顏色變化率（Average well color development，AWCD）在144 h的 數 據 計 算Biolog-ECO生態板中土壤微生物的群落代謝類型，用31個孔的AWCD表示微生物代謝的整體活性，土壤微生物群落多樣性指數包括物種豐富度指數（H）、均勻度指數（E）、碳源利用豐富度指數（S）、Simpson優勢度指數（D）。計算公式如下。

S=被利用碳源的總數

式中，C為每個孔的吸光值，R為對照孔的吸光值，n為孔數，ECO生態板n為31；Pi為第i孔的相對吸光值與所有反應孔相對吸光值總和的比值，即Pi=（C-R）/∑（C-R）［10，11］。

試驗數據采用Excel 2007軟件進行初步處理，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析（Duncan）和相關性分析（Pearson），采用Origin 2019軟件進行主成分分析、熱圖聚類分析，并繪制相關圖形。

2 結果與分析

2.1 菜薹尾菜原位還田對土壤速效碳、氮含量的影響

從圖1可以看出，不同處理間硝態氮含量差異均不顯著（P＞0.05）。隨著生育期的推進，CK處理硝態氮含量逐漸下降，60 d后下降了11.91%，而FS和FS-30N處理分別下降了14.02%和12.06%，且這2個處理土壤硝態氮含量的下降主要集中在45~60 d。菜薹尾菜原位還田經過60 d后，不同處理土壤硝態氮含量差異較小，主要集中在27.27~29.17 mg/kg。

圖1 不同處理土壤硝態氮含量

由圖2可知，與CK相比，FS-30N處理活性有機碳的含量下降了3.37%~10.37%，就FS處理而言，除了45 d略有增加外，其他時間則降低了4.06%~35.57%。隨著生育期的推進，土壤活性有機碳的含量相對趨于穩定，變化幅度較小。

圖2 不同處理土壤活性有機碳含量

2.2 菜薹尾菜原位還田對土壤微生物功能多樣性的影響

從表2可以看出，不同處理碳源利用能力多樣性指數在前30 d均沒有顯著差異。在45 d，CK的均一度指數顯著高于FS-30N，但FS與兩者差異都不顯著，且至60 d時，不同處理間的均一度指數又沒有顯著差異。就優勢度指數和香濃多樣性指數而言，只有在45 d和60 d，CK均顯著高于FS和FS-30N，且45 d FS與FS-30N香濃多樣性指數差異也達到了顯著水平。與CK相比，還田后30 d FS-30N碳源利用豐度指數顯著降低2.61，然而到了45 d，FS和FS-30N處理碳源利用豐度指數顯著低于CK，且分別減少了4.11和2.00，同時FS碳源利用豐度指數比FS-30N降低了2.11，且兩者差異達到顯著水平。還田后60 d，FS和FS-30N處理碳源利用豐度指數顯著低于CK，分別降低了2.00和1.77，但FS與FS-30N處理間差異不顯著。

表2 不同處理微生物功能多樣性分析

AWCD表征微生物群落對碳源的利用率。從圖3可以看出，菜薹尾菜原位還田后，與CK相比，FS和FS-30N處理AWCD均呈下降趨勢。尾菜還田后的30~60 d，CKAWCD（96~168h）顯著 高于FS和FS-30N（P＜0.05），且在45 d FS-30NAWCD（96~168 h）顯著高于FS（P＜0.05）。以培養120 h的AWCD對尾菜還田下不同處理土壤微生物碳源利用能力進行主成分分析。還田后10、20、30、45、60 d各處理分別提取了6、4、10、9、10個主成分，其累積方差貢獻率分別達82.06%、80.20%、84.77%、82.19%和80.54%，其中2個主成分的累積方差貢獻率分別達62.89%、69.87%、37.80%、42.35%和33.25%。

圖3 不同處理AWCD和PCA分析

尾菜還田后10 d FS和FS-30N碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、多聚物的OD顯著低于CK，且分別降低了32.57%和27.80%、27.51%和29.77%、43.93%和50.08%、31.55%和34.75%（圖4）。對于聚合物而言，與還田后10 d相比，還田后60 d CK、FS和FS-30NOD分別增加了28.32%、77.50%和102.56%。與還田后10 d相比，還田后60 d FS和FS-30N碳水化合物類、氨基酸類、羧酸類、酚酸、胺類的OD分別提高了29.49%和28.49%、42.70%和27.48%、42.70%和27.48%、33.21%和48.52%、84.58%和37.16%。

圖4 不同處理碳源利用能力分析

在移栽后10 d土壤對碳水化合物、氨基酸和羧酸類的利用能力較強，隨著時間的推進，土壤主要對碳水化合物和羧酸類具有較強的利用能力，而到移栽后45 d又以碳水化合物、氨基酸和羧酸類利用為主，到最后60 d則主要以碳水化合物和羧酸類為主。在整個過程中，酚酸、多聚物和胺類化合物中的2-羥基苯甲酸、吐溫-80和苯乙胺始終具有較高的利用能力。從圖5可以看出，尾菜還田后10 d土壤微生物功能多樣性發生了明顯的變化，還田以后也明顯地改變了土壤微生物功能多樣性。

圖5 碳源利用能力熱圖聚類分析

2.3 土壤活性碳氮與功能多樣性相關性分析

從表3可以看出，相比活性有機碳，硝態氮對六大類碳源的影響較大，其中對碳水化合物和多聚物的影響比較顯著。六大類碳源對多樣性指數的影響最大，其次是優勢度指數和豐度指數，對均一度指數的影響最小。多聚物對微生物功能多樣性的影響最大，其次是碳水化合物和氨基酸類。

表3 不同指標相關性分析

3 討論

尾菜還田后能夠改善土壤的理化性狀和作物品質，以及提高產量［12，13］。研究發現蔬菜廢棄物直接還田后能夠增加當季或者第二季作物產量［5，14，15］。然而，目前有關尾菜直接還田后對土壤基本性質影響的研究尚不多見。胡國平等［7］研究表明蔬菜廢棄物還田可以降低土壤硝態氮淋失風險。本研究表明，與常規施肥相比，在常規施肥基礎上尾菜還田后60 d土壤硝態氮含量增加了6.51%~21.18%，這與胡國平等［7］研究結果一致。然而在尾菜還田的基礎上化肥減施30%，土壤的硝態氮含量增加了3.79%~18.99%，此外，產量也沒有顯著差異，這也進一步說明了低碳氮比（17.5）菜薹尾菜還田增加了速效氮的礦化［7，16］。

土壤活性有機碳是評價土壤碳平衡和土壤化學、生物化學肥力保持的重要指標［17］。本研究結果表明，與常規施肥相比，菜薹尾菜還田后降低了土壤活性有機碳的含量。張玉軍等［18］研究發現長期有機肥和秸稈還田也降低了紅壤水稻土的活性有機質含量，但是大量的試驗研究發現施有機肥或者有機無機肥配施，較單施化肥顯著提高了土壤活性有機碳的含量［19］。這可能是尾菜與有機肥和秸稈之間碳氮比差異有關，高碳氮比增加了土壤微生物的活性，大量的速效碳氮被微生物自身消耗而使得土壤累積較少［18］。

研究尾菜還田對土壤微生物功能多樣性的影響，對于探索尾菜還田模式下的土壤綠色生態發展具有理論指導意義［20，21］。在本研究中，與常規施肥相比，尾菜還田后10 d土壤微生物功能多樣性發生了明顯的變化，對主要碳源的利用能力有所提高，但是與常規施肥相比，還田處理降低了土壤微生物功能多樣性，但是這種改變在60 d后得到了緩解。然而目前有關有機物料施入對于土壤微生物碳源利用能力多樣性影響的研究普遍表現為正向效益［22，23］，這主要的原因可能是低碳氮比尾菜（碳氮比17.5）大量還田同時配合化肥施用短期導致土壤碳氮比降低，影響了有機質的礦化，從而影響碳源利用能力［24］，此外還可能是因為本試驗值觀測了60 d，還田后的正向激發效應還未顯示出來，但是60 d已經有恢復的跡象。因此，大量的低碳氮比尾菜還田對土壤微生物碳源利用能力的影響還需要延長時間進一步觀測。

微生物群落碳源代謝強度和代謝類型的變化被認為是預測土壤質量變化最有潛力的敏感性生物指標。在本研究中土壤微生物碳水化合物和羧酸類具有較強的利用能力，且在追肥過后氨基酸類也表現出較強的利用能力。不同的試驗結果表明土壤微生物利用能力較高的碳源種類不一［25］，這可能是由于土壤生境的差異，造成的微生物對土壤碳源種類具有不同的偏好［22］。在本研究中硝態氮對土壤微生物功能多樣性的影響較大，因此，在尾菜還田后應該注意氮肥的運籌，從而避免微生物與植物爭“氮”［26，27］。

4 小結

1）在常規施肥基礎上尾菜還田后60 d土壤硝態氮含量增加了6.51%~21.18%，然而在尾菜還田的基礎上化肥減施30%土壤的硝態氮含量增加了3.79%~18.99%。還田后處理均降低了土壤活性有機碳的含量。

2）與常規施肥相比，尾菜還田和還田后化肥減施30%處理均降低了土壤碳源利用能力。尾菜還田后10 d土壤微生物功能多樣性發生了明顯的變化，但是60 d后處理間的差異有縮小的趨勢。還田后60 d內土壤微生物主要對碳水化合物和羧酸類具有較強的利用能力。

3）相比活性有機碳，硝態氮顯著影響碳水化合物和多聚物代謝。六大類碳源對多樣性指數的影響最大，對均一度指數的影響最小。多聚物、碳水化合物和氨基酸類對微生物功能多樣性的影響最大。