病毒樣顆粒疫苗的研究進展

譚 坤，張麗琳

（天津大學生命科學學院，天津300072）

病毒樣顆粒（VLPs）是由病毒的結構蛋白組裝形成的，與自然病毒結構相似的一類蛋白粒子，具有良好的生物活性和與病毒相同的免疫原性，是疫苗制備的良好選擇。疫苗一直是控制和預防傳染病最有效的方法之一。

傳統的疫苗主要是減毒疫苗和滅活疫苗，這些疫苗可以很好地激發機體的免疫反應，抵御疾病的傳播［1］，但是這些傳統疫苗也有一些明顯的缺陷，比如其安全性以及制作的困難性制約了疫苗在某些疾病上的使用。20世紀80年代以來，VLPs逐漸替代傳統疫苗成為疫苗制備的首選［2］。VLPs是一種多蛋白分子，大部分由幾個相同的蛋白質組成二十面體或螺旋結構，在與活病毒結構相似的同時缺失病毒的基因組，因此十分安全。迄今為止，已有多種VLPs疫苗實現商業化，證明是一種已經被大家承認的安全有效的疫苗。

1 VLPs疫苗的分類

根據原始病毒的結構，VLPs疫苗可以分為有包膜和無包膜兩類。無包膜的VLPs疫苗只包含由病毒的蛋白形成的顆粒［1］，如諾瓦克病毒和戊型肝炎病毒。有包膜的病毒除了病毒本身的蛋白外，還包含宿主的細胞膜［3］，比如A型流感病毒和乙型肝炎病毒［4，5］。

根據制備的VLPs疫苗的結構，可以將VLPs疫苗分為四類：VLPs疫苗、嵌合VLPs疫苗、VLPs交聯疫苗以及VLPs沖擊的樹突狀細胞（DCs）疫苗。VLPs疫苗是最簡單的VLPs疫苗，它利用了病毒蛋白組裝形成與病毒結構相似的顆粒，激起機體的免疫反應，達到預防疾病的效果。嵌合VLPs疫苗是在VLPs疫苗的基礎上，在VLPs的外部連接一些關鍵的抗原蛋白，從而提高疫苗的免疫原性［6］。但是嵌合VLPs疫苗的成功表達和組裝是一個需要耐心探究的過程，同時還需要限制插入蛋白的大小。VLPs交聯疫苗也是將外來抗原連接到VLPs外部，方法是將一個或多個賴氨酸添加到VLPs的免疫反應區，同時將半胱氨酸添加到外來抗原上，然后利用化學交聯劑把外來抗原連接到VLPs表面［7］。VLPs沖擊的樹突狀細胞（DCs）疫苗利用機體特異性產生的樹突狀細胞，將樹突狀細胞與VLPs結合，使疫苗具有很好的靶向性和免疫治療效果［7］。

根據VLPs疫苗的功效，可以將VLPs疫苗分為預防型疫苗和治療型疫苗兩類。

2 VLPs疫苗的優勢

從20世紀80年代以來，VLPs逐漸成為了一種安全有效的疫苗。VLPs是由病毒蛋白組成的具有和病毒結構十分相似結構的粒子，包含病毒的很多特征，因此可以很好地用于疫苗的開發。VLPs可以形成獨特的重復表面結構，這種剛性的重復表面結構是一種強有力的促進B細胞交聯的幾何結構，可以很大地激起機體的免疫反應［8，9］。體液免疫過程中包含很多多聚體，促進了與VLPs的結合，從而提高了抗原提呈細胞對VLPs的定位和攝取［10］，增強了免疫系統的適應性［11］。因此，VLPs作為疫苗具有很多傳統疫苗的特點，同時本身并不具有病毒核酸，不會在機體內復制，提高了疫苗的安全性［10］。VLPs疫苗的研發時間較傳統疫苗相比時間較短，可以迅速應對流行病的爆發。目前，有很多VLPs疫苗已經商品化，包括乙型病毒肝炎疫苗［12］、人乳頭瘤病毒疫苗［13］以及戊型肝炎病毒疫苗［14］等，證明VIPs疫苗具有很好的免疫性和安全性。

3 VLPs疫苗的表達系統

VLPs的表達系統有很多，總計有170多種，常用的是5種表達系統：細菌表達系統，使用率為28%；昆蟲表達系統，使用率為28%；酵母表達系統，使用率為20%；哺乳動物細胞表達系統，使用率為15%；植物表達系統，使用率為9%。不同表達系統的優缺點比較見表1。

表1 不同表達系統的比較

3.1 細菌表達系統

細菌表達系統是VLPs表達過程中最常用的表達系統。在利用細菌表達系統制備VLPs時，可以將病毒的結構蛋白基因優化為細菌喜好的密碼子，同時將病毒基因插入到具有強啟動子的載體上，從而顯著增加外源蛋白的表達量［15，16］。作為目前使用最廣泛的表達系統之一，細菌的遺傳背景清晰，可以適應不同的載體和宿主菌，同時它又具有繁殖速度快、培養價格低、產量高等優點。但是細菌表達系統的缺點也很明顯，細菌缺乏轉錄后剪切、翻譯后修飾的能力，在VLPs表達方面具有一定的局限性［17］。目前用細菌表達的VLPs疫苗有人乳頭瘤病毒疫苗和豇豆褪綠斑駁病毒疫苗等。

3.2 昆蟲表達系統

昆蟲表達系統利用桿狀病毒作為穿梭載體，通過轉座作用將表達所需的元件連接到載體上，然后將載體轉染昆蟲細胞，得到包含外源蛋白完整轉錄單位載體的重組病毒。然后用病毒感染細胞，培養后即可獲得重組蛋白。昆蟲表達系統可以進行良好的翻譯后修飾，如糖基化、乙酰化、磷酸化等，從而讓蛋白進行正確的折疊，使重組蛋白的結構和功能與天然蛋白更加相似，同時表達大分子量的外源蛋白（0~200 kDa）也是昆蟲表達系統的一項優點。但是昆蟲表達系統也有細胞生長緩慢、培養基昂貴以及病毒感染會導致宿主死亡等缺點［18］。HPV的雙價VLPs疫苗以及藍舌病病毒疫苗都是用昆蟲桿狀病毒系統表達生產的。

3.3 酵母表達系統

酵母表達系統是一種常用的表達系統，相較于原核生物表達系統，酵母表達系統可以進行較好的轉錄翻譯后的修飾，使表達的蛋白更加接近于天然蛋白，同時它又具有原核生物生長速度快、培養簡單和價格低廉的優點，是一種普遍使用的真核表達系統［19］。酵母的種類有很多，畢赤酵母和釀酒酵母是常用的兩種。畢赤酵母具有強啟動子——AOX［20］，利用甲醇進行誘導可以明顯提高外源基因的表達。釀酒酵母用于食品加工已經有悠久歷史，因此十分安全可靠。同時，釀酒酵母進行了全基因組測序，遺傳背景清晰，方便遺傳操作［21，22］。目前，市面上銷售的HPV九價疫苗就是利用釀酒酵母表達生產的。

3.4 哺乳動物細胞表達系統

哺乳動物細胞表達系統可以準確且復雜地轉錄翻譯后修飾，使組裝的VLPs的分子結構、理化特性和生物功能與天然病毒蛋白最接近，能夠保證免疫原性。但是，哺乳動物細胞培養條件復雜、價格昂貴以及表達量較低等缺點也制約其在工業上的應用［23］。中國長春生物制品所利用哺乳動物細胞制備的乙肝疫苗已經投入生產，具有良好的效果。利用哺乳動物細胞表達系統生產的VLPs可以準確進行復雜的轉錄翻譯后修飾，使表達產物在分子結構、理化特性和生物功能上最接近天然病毒蛋白，具有很好的免疫原性。但是哺乳動物細胞培養條件復雜、價格昂貴以及表達量較低等缺點也制約其在工業上的應用［23］。

3.5 植物表達系統

植物表達系統主要利用植物病毒載體和農桿菌將要表達的基因轉染到植物細胞內，使其大量表達外源蛋白［24］。最先利用植物表達系統研制的疫苗主要是口服疫苗，后來開始轉向注射疫苗，使疫苗的生產使用更加準確［25］。在轉基因植物中，VLPs疫苗研究較好的是諾瓦克病毒疫苗［20］。

4 VLPs疫苗的純化與組裝

病毒樣顆粒的純化主要包括4個步驟，分別是裂解、粗提、濃縮和精制［26］。在制備VLPs的過程中，需要在保證質量的同時，選擇簡單高效的方法。

裂解：在進行蛋白表達的時候，很多時候在蛋白的前端添加信號肽，將蛋白分泌到細胞外。但是在某些情況下，組裝VLPs的蛋白無法分泌到胞外，純化這類的VLPs就需要進行細胞裂解［27］。處理不同的細胞會選擇不同的方法，對于哺乳動物和昆蟲細胞來說，去污劑處理是細胞裂解最常用的方法，而高壓、超聲、研磨以及凍融等方法［28，29］則多用于細菌、酵母和植物細胞。在這個過程中，最重要的是防止蛋白降解，所以需要根據蛋白特性配置不同的緩沖液，并在其中加入蛋白酶抑制劑和蛋白穩定劑［30］。

粗提：裂解細胞之后進行粗提，在這一步將細胞碎片和大聚合物去掉［31］。離心是蛋白粗提過程中常用的方法，一般使用低速離心機或者連續流離心機［27］。連續流離心機的分離效果比較好，而且可以將細胞裂解液連續導入，方便快捷。另外使用0.45 μm的濾膜也可以有效去除細胞碎片，達到粗提的效果。

濃縮：濃縮在粗提之后，主要的目的是去除雜蛋白和提高目的蛋白濃度。濃縮的方法有很多，包括硫酸銨沉淀、聚乙二醇沉淀、蔗糖氯化銫梯度超速離心、離子交換層析等［32］。近些年來，利用Monoliths制作的離子交換柱、疏水層析柱或親和層析柱也成為濃縮蛋白的良好工具［27］。

精制：當VLPs應用于臨床時，濃縮后的VLPs需要精制。精制的主要目的是去除表達系統宿主本身的蛋白質和DNA，同時去除純化相關雜物。精制主要采取離子交換層析、膜裝置和分子排阻等方法。

經過純化處理后，對于表達的單體蛋白還需要進行正確的組裝，不完全或者不規則的組裝會導致VLPs疫苗效果的下降，因此，需要對VLPs進行去組裝和重組裝處理，以提高VLPs的穩定性、均一性和免疫原性［33］。不同的VLPs需要不同的緩沖液進行去組裝和重組裝，需要不斷地研究與探索。HPV16 L1 VLPs的去組裝需要在高pH、低鹽和還原劑的溶液下進行，重組裝需要在低pH、高鹽和去還原劑的條件下進行［31］。

5 病毒樣顆粒的鑒定

在制備VLPs的過程中，要對VLPs的制備情況進行檢測，因此必須要有良好的檢測與鑒定VLPs的方法。檢測VLPs主要通過4個方面：性質、含量、效果和純度。

性質：VLPs性質的檢測主要包括VLPs的形態、大小、氨基酸序列、相對分子質量、降解修飾情況、中和表位、抗原特異性等方面［34］。性質檢測的方法有很多，比如SDS/PAGE法、Western Blot法、ELISA法、表面等離子體共振技術、投射電子顯微鏡法、免疫電鏡法、蛋白質測序法、質譜法等。

含量：含量是VLPs檢測中很重要的一步，關系到VLPs疫苗使時的用量。主要的方法有ELISA法、BCA法、Bradford法、紫外分光光度法等。

效力：VLPs的效力檢測是證明VLPs疫苗效果的關鍵。主要包括體外試驗，如血凝抑制試驗；體內試驗，如免疫試驗、攻毒試驗等。

純度：VLPs純度是檢測純化和精制效果的關鍵，同時也與能否用于臨床試驗相關。純度檢測主要檢測VLPs結構蛋白的純度、VLPs的組裝率、宿主DNA和蛋白的殘余、蛋白核酸復合物的多少等。主要的方法有ELISA法、SDS/PAGE法、DNA染色方法、瓊脂糖凝膠電泳遲滯試驗、透射電鏡檢測法等［30］。

使用透射電鏡觀察VLPs是檢測VLPs大小、形態和分布最快捷、最有效的方法，在投射電鏡下可以很清晰地看到VLPs的形態與大小，并可以通過形態和大小推測VLPs的效力［35］。VLPs的效力主要通過3個試驗證明：體外中和抗體結合試驗，檢測VLPs的抗原性；病毒中和試驗，檢測VLPs誘導產生抗體的病毒中和活性；動物免疫試驗，檢測血清中的抗體和抵御病毒的能力［34］。

6 VLPs疫苗激發的免疫通路

VLPs的大小在20~200 nm，因此可以很自由地通過存在200 nm大小孔壁的淋巴管，在淋巴系統內穿梭。最新的研究顯示，在小鼠腳墊部位注射20~30 nm的VLPs，10 min內可以在淋巴細胞內檢測到積累［36］。一般來說，VLPs進入細胞通過兩步：首先通過內皮細胞壁的血管孔自由擴散到淋巴細胞內，然后通過被動運輸進入淋巴結的被膜下竇［37］。

VLPs的表面排列著大量重復的抗原表位，因此可以很好地激起機體的免疫反應。VLPs在進入機體后，憑借與病原體分子的相似結構，可以被宿主的模式受體識別（Toll樣受體）并且被抗原提呈細胞捕獲［38］，然后通過MCHⅠ類分子通路交叉呈遞活化CD8+T細胞。VLPs也可以作為外源性抗原被樹突狀細胞識別，然后通過MCHⅡ類分子呈遞，直接促進樹突狀細胞的遷移與成熟，刺激先天性免疫反應，刺激免疫模式與原病毒相同［39-42］。活病毒在感染機體后在樹突狀細胞內繁殖時，會表達一些特定的蛋白阻止細胞的活化和成熟，而VLPs可以很好地避免這一問題［43］。

7 VLPs疫苗的修飾

為了使疫苗可以有效地誘導抗體反應，在設計疫苗時應考慮以下幾點：①疫苗的目標抗原要以真實自然的狀態呈遞給B細胞［44］。②設計的疫苗可以有效地通過B細胞受體成功激活B細胞［45，46］。③疫苗可以使用不同的Toll樣受體裝配VLPs，作為佐劑來增強機體免疫反應［47-49］。這些設計都可以通過不同的修飾方法實現。

化學修飾技術主要是通過化學方法修飾VLPs表面的氨基、羧基、磺酰基以及羥基，其中賴氨酸殘基是VLPs表面最常用的修飾靶點，主要通過將N-羥基琥珀酰亞胺脂與游離的賴氨酸反應形成穩定的酰胺鍵，在VLPs表面連接其他抗原蛋白。肼連接化學［50］和點擊化學［51］是2種常用的修飾表面氨基酸的方法。點擊化學以及最近開發的無銅點擊化學已經廣泛用于VLPs修飾，比如VLPs與腫瘤相關抗原的偶聯［52-54］。在工業上VLPs化學修飾主要通過雙功能交聯劑實現，可以在VLPs表面連接任何抗原。比如通過碳亞二胺可以將豇豆花葉病毒表面的180個羧基鹽與抗癌藥阿霉素偶聯［55］。

當連接抗原特別大時，化學修飾就不能使用了，這時可以利用基因修飾的方法來改變VLPs的結構。基因修飾的主要原理是引入外源多肽和抗原，分為直接引用和通過改造基因組引入。高免疫原性的乙型肝炎核心抗原就是利用了基因修飾加入了特定序列，從而提高了疫苗的免疫效果［56］。這項技術最開始的時候用于在表達蛋白的末端加入短肽，最近已經發展為可以在其他部位加入長的肽段。這主要利用了分離蛋白核心的技術，在特定的部位人為加入終止子和啟動子，使蛋白分離成為多個不同的核心，從而在核心之間插入抗原，這項技術可以表達300個氨基酸以上的偶聯蛋白［57，58］。另一種相似的方法稱為串聯核技術，在已經穩定組裝連接的VLPs中加入主要免疫核心［59］。最后一種基因修飾技術是在VLPs中插入或突變氨基酸，可以提高在表達宿主中的穩定性和表達效率。將煙草馬賽克病毒衣殼蛋白中的天冬氨酸和谷氨酸突變為天冬酰胺和谷氨酰胺，可以提高蛋白在宿主細胞內的組裝能力［60］。

病毒顆粒的內部本來是病毒的核酸，在表達病毒蛋白組裝成VLPs時，其內部的核酸被去除，提高了疫苗的安全性。后來發現，可以通過在VLPs的內部加入相應的佐劑，從而提高疫苗的免疫效果。在VLPs內部加入的大部分是激活樹突狀細胞的佐劑，包括dsRNA、ssRNA和非甲基化CPGs，分別激活TLR3、TLR7/8和TLR9。將這些佐劑包裹到VLP中，可以很好地將佐劑運輸到抗原提呈細胞，然后VLPs的蛋白外殼被降解，Toll樣配體釋放刺激相應受體［8，61］。

8 VLPs疫苗的研發

8.1 乙型肝炎（HBV）VLP疫苗

乙型肝炎的VLP疫苗已經研發了3代，是一款比較成熟的疫苗。1965年巴魯克·布隆伯格從乙肝感染者血液中分離出來抗原性物質Aa，這一發現，使得乙肝疫苗的研制成為可能［62］。第一代疫苗出現于20世紀80年代，第二代疫苗利用釀酒酵母表達乙肝病毒的SHBs小蛋白制備，它為母體感染乙肝病毒的新生兒提供了有效的保護，并在世界范圍內顯著降低了乙肝病毒的感染率［63］。最近，基于乙型肝炎表面抗原的第三代疫苗已經在以色列以及其他14個東亞國家使用，在30萬人中顯示了很好的安全性和有效性，它在免疫低下的老年人和腎衰竭的人群中具有更好的效果。它利用了中國倉鼠卵巢細胞表達的S、Pre-S1和Pre-S2 3種乙型肝炎表面抗原組裝而成。該疫苗可以在2.5~10.0 μg范圍劑量下誘導產生高滴度的抗體，有人認為可以作為治療性疫苗用于慢性乙型肝炎病毒感染。

8.2 人乳頭瘤病毒（HPV）VLP疫苗

2006年，第一個HPV VLP疫 苗Gardasil?在美國批準使用，它由6、11、16、18型HPV病毒的主要衣殼蛋白L1和中性鹽羥基鋁硫酸磷酸鹽佐劑組成。到2014年，Gardasil?已經被覆蓋范圍更廣的Garda?sil9?替代，它增加了31、33、45、52和58型的HPV病毒蛋白，研究表明，20%的宮頸癌是由這些新增加的HPV病毒感染引起的［63］。

9 展望

利用VLPs開發疫苗是近些年來迅速發展的一門學科，它結合了免疫學、微生物學、病毒學和疫苗學的相關知識，已經成為制備疫苗的熱門選擇。VLPs以其簡單、穩定、安全以及獨特的結構吸引著眾多科學家的目光。在當今的研究中，VLPs已經不僅單純作為疫苗而使用，更成為疫苗研究以及更多研究的優秀工具。隨著對VLPs研究的加深，VLPs將會給疫苗研發帶來更多的機遇。