miR-519d-3p通過調控TLR4/NF-κB通路促進脂多糖誘導的肺上皮細胞凋亡

周垂楊 柯樂斌 高仁賢

急性肺損傷(acute lung injury，ALI)是臨床上常見的急危重癥，由多種炎性細胞因子和免疫細胞共同參與，以彌漫性肺泡損害導致嚴重低氧血癥為特征，ALI及其嚴重階段急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)是胸外傷、大面積燒傷和嚴重感染性疾病的主要致死原因[1, 2]。目前，臨床上對ALI/ARDS的治療以對癥支持治療為主，尚缺乏有效的治療手段和特效藥，患者病死率仍高達30%～50%[3]。因此，探討ALI的發病機制，尋找一種新的治療策略是極其重要和緊迫的。急性肺損傷的發病機制是復雜的，包括中性粒細胞的募集、炎性細胞因子的釋放和上皮細胞的凋亡，這些因素導致了肺泡上皮屏障的破壞、肺水腫和氣體交換的異常[4]。在 ALI 的各種致病因素當中，以內毒素(主要成分是脂多糖 LPS)最為常見。

研究表明microRNA在調控ALI發生、發展方面具有重要意義[5]。已有研究發現，miR-146a高表達可明顯抑制 LPS 誘導的小鼠肺組織中誘導型一氧化氮合酶 (iNOS)、炎性細胞因子TNF-α、白介素-6(IL-6)和IL-1β釋放[6]。microRNA-181b能夠調節NF-κB介導的血管炎癥，并且降低內毒血癥性小鼠的肺損傷[7]。而miR-127則可下調FcγRI/CD64的表達，減少IgG IC誘導的小鼠過度肺部炎性反應[8]。靶向特異性的miRNA可作為一種新型的分子標志物，用于評估及監測ALI的發生、發展，對改善ALI患者肺部功能和預后具有重要意義。

本研究通過細胞實驗研究了miR-519d-3p對脂多糖LPS誘導的肺上皮細胞A549細胞凋亡的影響及其具體作用機制，對探索新的ALI診療手段具有重要意義，一定程度上為ALI的分子治療靶點提供了新的研究策略。

材料與方法

1.細胞培養及其分組：人肺上皮細胞A549購自美國模式培養物保藏所。A549培養在含胎牛血清的DMEM培養基中，并在37℃，5%CO2的細胞培養箱中培養。利用脂多糖LPS處理A549模擬急性肺損傷體外細胞模型[9]。LPS溶解在二甲基亞砜(濃度<0.1%)中。分別用0、100、1000、104ng/ml的LPS處理A549細胞24h，摸索LPS后續處理濃度。NF-κB抑制劑 Bay 11-7082預處理濃度為5μmol/L，預處理時長為1h，之后撤掉抑制劑進行后續處理。細胞分組按相應實驗要求分為：對照組(不做任何處理)、LPS處理組、LPS+miR-519d-3p激動劑組、LPS+miR-519d-3p拮抗劑組、LPS+Bay 11-7082組、LPS+Bay 11-7082+miR-519d-3p激動劑組。

2．細胞轉染：A549細胞于轉染前一天接種于6孔板中，細胞培養箱內培養過夜后，用lipofectamineTM2000(美國Invitrogen公司)轉染細胞。將miR-519d-3p拮抗劑或激動劑用opti-MEM(美國Gibco公司)稀釋，lipofectamineTM2000在另外離心管中稀釋后，兩者混合室溫靜止20min，緩慢滴加至鋪好細胞的培養板中繼續培養。于4h換液后繼續后續處理。

3.qRT-PCR檢測miR-519d-3p水平：使用TRIzol試劑盒(美國Thermo Scientific公司)提取A549細胞總的miRNA。然后使用Taqman MicroRNA反轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司)合成cDNA。運用7900HT快速實時PCR系統(美國Applied Biosystems公司)進行定量PCR檢測。使用2-△△CT法測定相對miRNA水平。內參為U6。miR-519d-3p引物序列如下：正向引物5′-TGCGGCAAAGTGCCTCCCTTTAG-3′；反向引物5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。

4.流式細胞儀檢測細胞凋亡：使用 Annexin V-FITC/PI 染色試劑盒(美國BD Biosciences公司)檢測A549細胞的凋亡率。不同分組的A549細胞經過相應的處理后，將細胞濃度調整為1×106個/毫升。使用結合緩沖液懸浮，10μl Annexin V-FITC和碘化丙啶(PI)添加到100μl細胞懸浮液中，室溫遮光孵育15min。使用流式細胞儀(美國BD Biosciences公司)檢測凋亡細胞。

5.Western blot法檢測蛋白表達：使用RIPA裂解緩沖液(美國Thermo Scientific公司)裂解各處理組A549細胞。再使用BCA蛋白定量試劑盒(美國Thermo Scientific公司)測定了蛋白質的濃度。用10%的SDS-PAGE分離蛋白質，并轉移到硝化纖維素膜(NC膜)上。然后，使用5%脫脂奶粉封閉NC膜。緊接著，一抗Bax(#33-6400)、caspase-3(#PA5-114687)、Bcl-2(#13-8800)、TLR4(#48-2300)、p-IκBα(#2859)、IκBα(#4814)、p-p65(#MA5-15160)和p65(#51-0500)過夜孵育。次日，二抗孵育?；瘜W發光法檢測蛋白條帶。p-IκBα和IκBα抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，其余抗體均購自美國Invitrogen公司。β-actin作為內參。

6.細胞免疫熒光檢測 NF-κB p65蛋白細胞核移位：細胞按相應實驗條件處理后，4%多聚甲醛室溫固定A549細胞，然后0.2% Triton X-100打孔，3% BSA封閉1h。加入一抗 (抗NF-κB，1∶100稀釋) 孵育2h。緊接著，二抗避光孵育1h。洗滌后加入DAPI染核，避光孵育30min。最后，使用熒光顯微鏡觀察拍照。

結 果

1.LPS上調A549的miR-519d-3p水平：LPS處理后的A549細胞內miR-519d-3p水平上調，并呈濃度依賴性(圖1)。由于LPS濃度為104ng/ml時，miR-519d-3p水平與1000ng/ml比較，未顯著上調，因此本研究選擇LPS濃度為1000ng/ml，處理時間為24h構建急性肺損傷體外細胞模型。

圖1 LPS處理A549細胞內miR-519d-3p水平與0ng/ml比較，*P=0.000

2.miR-519d-3p促進A549細胞凋亡：轉染miR-519d-3p激動劑，發現miR-519d-3p水平顯著上升；轉染miR-519d-3p拮抗劑，發現miR-519d-3p水平顯著下調(圖2A)。流式細胞儀檢測細胞凋亡結果發現，LPS誘導細胞凋亡，過表達miR-519d-3p使得細胞凋亡進一步被促進；下調miR-519d-3p表達，細胞凋亡被一定程度抑制(圖2B)。同時，Western blot法檢測凋亡相關蛋白表達。LPS誘導后，Bax和cleaved caspase-3表達上調，Bcl-2表達下調；過表達miR-519d-3p使得Bax和cleaved caspase-3表達進一步上調，Bcl-2表達下調；下調miR-519d-3p表達，Bax和cleaved caspase-3表達下調，Bcl-2表達上調(圖2C)。

圖2 miR-519d-3p對A549細胞凋亡的影響A.qRT-PCR檢測miR-519d-3p水平；B.流式細胞儀檢測細胞凋亡；C.Western blot法檢測Bax、cleaved caspase-3和Bcl-2蛋白表達水平

3.miR-519d-3p影響TLR4/NF-κB通路：LPS處理使得TLR4、p-IκBα和p-p65蛋白水平顯著上調。同時，上調miR-519d-3p水平，TLR4、p-IκBα和p-p65蛋白水平進一步上調；下調miR-519d-3p水平，TLR4、p-IκBα和p-p65蛋白水平隨之下調(圖3A)。利用細胞免疫熒光實驗檢測NF-κB蛋白細胞核移位，結果發現，上調miR-519d-3p水平能夠明顯誘導NF-κB蛋白的細胞核移位，使得細胞核內NF-κB蛋白水平顯著上升；下調miR-519d-3p水平，細胞核內NF-κB蛋白水平下調(圖3B)。

圖3 miR-519d-3p對TLR4/NF-κB通路的影響(×200)A.Western blot法檢測TLR4、p-IκBα、IκBα、p-p65、p65蛋白表達水平；B.細胞免疫熒光檢測NF-κB蛋白細胞核移位

4.NF-κB抑制劑可緩解LPS導致的miR-519d-3p上調引起的A549細胞凋亡：NF-κB特異性抑制劑 Bay 11-7082處理后，miR-519d-3p水平(圖4A)和TLR4蛋白表達沒有顯著的改變，但p-IκBα和p-p65表達顯著下調(圖4B)，細胞凋亡水平顯著下降(圖4中C～D)；然后轉染miR-519d-3p激動劑后，miR-519d-3p水平和TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達顯著上調，細胞凋亡水平也隨之升高。

圖4 NF-κB抑制劑Bay 11-7082對A549細胞凋亡的影響A.qRT-PCR檢測miR-519d-3p水平；B.Western blot法檢測TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達水平；C.流式細胞儀檢測細胞凋亡；D.Western blot法檢測細胞凋亡相關蛋白表達水平

討 論

ALI主要以肺部炎癥和細胞凋亡為特征，是一種人類常見的臨床疾病，在ALI的發展中，細胞凋亡被認為與ALI的嚴重程度密切相關[10]。肺泡Ⅱ型上皮細胞的凋亡已被證明是導致ALI中上皮屏障功能損傷和某些間充質細胞重塑的原因[11]。細胞凋亡途徑的失控激活會導致炎癥和肺組織的破壞，抑制細胞凋亡能夠治療ALI。同時，大量的研究已經明確了miRNAs在ALI 的發生和發展中的重要作用。Fu等[12]研究發現，下調miR-181a能夠通過靶向Bcl-2減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷。Tang等[13]研究報道，miR-126-5p在LPS誘導的ALI小鼠中也起了類似的作用靠下調血管內皮生長因子A(VEGFA)。Wu等[14]研究發現，miR-326 靶向BCL2A1基因激活NF-κB信號通路，加重了ALI小鼠感染性休克的炎性反應和肺損傷。

脂多糖(LPS)是革蘭陰性細菌細胞壁的主要生物活性成分，已被廣泛用于誘導ALI模型[15]。本研究利用LPS處理人肺上皮細胞A549模擬ALI細胞模型。LPS能夠上調A549細胞中的miR-519d-3p水平，并呈濃度依賴性。同時發現miR-519d-3p能夠促進A549細胞的細胞凋亡。已有研究表明，miR-519d-3p 通過靶向HIF-2α能夠促進缺氧條件下HeLa細胞凋亡，抑制增殖[16]。miR-519d-3p在喉部鱗狀細胞癌中也有同樣的作用[17]。但miR-519d-3p促進LPS誘導的A549細胞凋亡具體作用機制還需進行進一步的研究。

綜上所述，本研究發現，LPS處理能夠改變miR-519d-3p水平，進而影響TLR4/NF-κB通路相關蛋白表達。上調miR-519d-3p水平能夠激活TLR4/NF-κB通路。有研究表明，TLR4/NF-κB通路與細胞凋亡相關[18]。miR-519d-3p水平上調能夠促進TLR4蛋白表達。TLR4是LPS最主要的受體[19]。LPS與TLR4蛋白結合，啟動信號轉導，然后導致NF-κB激活，引起核內細胞凋亡相關基因廣泛轉錄，誘導大量凋亡相關蛋白生成，誘導細胞凋亡發生[20]。本研究應用NF-κB特異性抑制劑 Bay 11-7082預處理A549細胞，發現細胞凋亡水平顯著下降，再轉染miR-519d-3p激動劑，LR4/NF-κB通路相關蛋白表達顯著上調，細胞凋亡水平也隨之升高。進一步驗證了miR-519d-3p通過調控TLR4/NF-κB通路影響細胞凋亡。

綜上所述，本研究探討了miR-519d-3p/TLR4/NF-κB通路對LPS誘導的肺上皮細胞凋亡的調控機制，為miR-519d-3p/TLR4/NF-κB通路作為ALI藥物靶點開發提供了理論基礎，具有一定的轉化價值。但miR-519d-3p對于TLR4蛋白表達的具體調控作用機制需在后續進行深入研究。