成人重癥哮喘誘導(dǎo)痰差異表達(dá)基因生物信息學(xué)分析

陳曉文 李中鵬 王 芳 李章紊 吳 健

支氣管哮喘是全球范圍內(nèi)最常見的慢性呼吸道疾病之一，根據(jù)Th2 細(xì)胞因子是否參與其病理生理發(fā)展可將哮喘分為2 型和非2 型[1]。全球哮喘患者達(dá)3.58億，患病率較1990年增加了12.6%[2]。王辰院士團(tuán)隊(duì)于2019年在《Lancet》雜志上發(fā)表了中國哮喘流行病學(xué)研究結(jié)果，中國哮喘病人總數(shù)約有4570萬，20歲及以上人群的哮喘患病率為4.2%，其中重度哮喘占5.99%，提示我國哮喘防控形勢嚴(yán)峻[3]。

持續(xù)24h仍不緩解的哮喘稱為哮喘持續(xù)狀態(tài)或重癥哮喘。重癥哮喘的臨床表現(xiàn)為發(fā)作性呼氣性呼吸困難，雙肺哮鳴音的呼吸系統(tǒng)急癥。重癥哮喘患者癥狀不受控制、經(jīng)常惡化，伴隨著肺功能的下降，嚴(yán)重影響患者的生存質(zhì)量，甚至危及生命[4, 5]。近年來針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的研究，使阻斷多個(gè)分子靶點(diǎn)的生物制劑出現(xiàn)成為可能，如與免疫球蛋白E(IgE)、白介素(IL)-4、IL-5和IL-13等2型炎癥生物學(xué)標(biāo)志物升高相關(guān)的2型哮喘。然而，2型炎癥僅能解釋約半數(shù)重癥哮喘發(fā)病機(jī)制，而關(guān)于非2 型哮喘的研究較少[6]。

誘導(dǎo)痰細(xì)胞學(xué)是確定哮喘炎癥表型的金標(biāo)準(zhǔn)，常用于評(píng)估氣道炎癥[7]。隨著組學(xué)研究的興起，利用誘導(dǎo)痰尋找重癥哮喘新生物學(xué)標(biāo)志物的方法取得了突破[8]。篩選新的靶點(diǎn)，有可能作為重癥哮喘患者治療新靶標(biāo)。本研究對(duì)正常人與重癥哮喘患者誘導(dǎo)痰基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，旨在鑒定候選的重癥哮喘疾病進(jìn)展中誘導(dǎo)痰顯著差異表達(dá)的關(guān)鍵基因。

材料與方法

1.數(shù)據(jù)集篩選:NCBI的GEO數(shù)據(jù)庫(Gene Expression Omnibus,GEO)是一個(gè)公共功能基因組數(shù)據(jù)庫，創(chuàng)建于2000年，收錄全世界各國研究機(jī)構(gòu)提交的高通量基因表達(dá)數(shù)據(jù)。本研究從GEO(Affymetrix GPL13158平臺(tái)，Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array)下載基因表達(dá)數(shù)據(jù)集(GSE137268)，數(shù)據(jù)集中包含33例重癥哮喘誘導(dǎo)痰樣本(嗜酸性粒細(xì)胞哮喘13例，非嗜酸性哮喘20例)和15例正常對(duì)照誘導(dǎo)痰樣本。

2.獲取差異基因:使用Benjamini&Hochberg方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用R語言軟件作火山圖。矯正后P<0.05同時(shí)log2(差異倍數(shù))≥0.58認(rèn)為上調(diào)基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；矯正后P<0.05同時(shí)log2(差異倍數(shù))≤-0.58認(rèn)為下調(diào)基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]。

3.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建:使用String數(shù)據(jù)庫構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，String數(shù)據(jù)庫可用于了解已知的蛋白相互作用，這些數(shù)據(jù)來源于其他已經(jīng)過驗(yàn)證的數(shù)據(jù)庫或?qū)嶒?yàn)室原始數(shù)據(jù)，也可用于預(yù)測蛋白相互作用。使用Cytoscape進(jìn)一步處理數(shù)據(jù)，并使用MCODE確定蛋白互作網(wǎng)絡(luò)中最重要的模塊。選擇的標(biāo)準(zhǔn)為：MCODE評(píng)分>5分，度截止=2分，結(jié)點(diǎn)得分截止=0.2分，最大深度=100分，K-Score=2分[10]。

4.差異基因富集分析:《京都基因與基因組百科全書》(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)，是一個(gè)用于從高通量實(shí)驗(yàn)技術(shù)產(chǎn)生的大規(guī)模分子數(shù)據(jù)集中了解高級(jí)功能和生物系統(tǒng)的數(shù)據(jù)資源庫。GO是用來注釋基因和分析基因生物學(xué)過程的主要生物信息學(xué)工具[11]。為了分析差異基因的功能，使用R軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與可視化，R語言軟件包ClusterProfiler用于富集分析[12]。

結(jié) 果

1.差異表達(dá)基因篩選:GSE137268數(shù)據(jù)集檢測到22185個(gè)基因，其中顯著上調(diào)(矯正后P<0.05及l(fā)og2(差異倍數(shù))≥0.58)70個(gè)；顯著下調(diào)(矯正后P<0.05及l(fā)og2(差異倍數(shù))≤-0.58)31個(gè)。前10位顯著上調(diào)和下調(diào)基因詳見表1。圖1顯示了差異表達(dá)基因的分布情況。

表1 前10位顯著上調(diào)和下調(diào)基因

圖1 差異表達(dá)基因火山圖log2(差異倍數(shù)).對(duì)差異表達(dá)倍數(shù)值取log2，橫坐標(biāo)的絕對(duì)值越大，表明基因表達(dá)量在兩個(gè)樣本間的倍數(shù)差異越大;-lg(P).對(duì)P值取-lg，縱坐標(biāo)值越大，表明差異基因的表達(dá)越顯著。上調(diào)基因用紅色點(diǎn)表示；下調(diào)基因用綠色點(diǎn)表示；非顯著差異的基因用灰色點(diǎn)表示

2.蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建:差異表達(dá)基因的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)包含40個(gè)節(jié)點(diǎn)和52個(gè)邊，詳見圖2A。通過Cytoscape下的 MCODE插件，篩出一個(gè)最顯著的模塊，共5個(gè)節(jié)點(diǎn)，包含jumonji富含at結(jié)合結(jié)構(gòu)域2(jumonjiandat-rich interaction domain containing 2，JARID2)、組蛋白2簇h2ac (recombinant histone cluster 2，HIST2H2AC)、組蛋白2簇h2aa3(recombinant histone cluster 2, h2aa3，HIST2H2AA3)、組蛋白2簇h2be(recombinant histone cluster 2, h2be，HIST2H2BE)、多同源性蛋白2(polyhomeotichomolog 2，PHC2)，詳見圖2。

圖2 差異表達(dá)基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖及關(guān)鍵模塊A.差異表達(dá)基因蛋白互作網(wǎng)絡(luò)；B.差異表達(dá)基因關(guān)鍵模塊

3.差異基因富集分析:在滿足矯正后P<0.05 且Q<0.2條件下，重癥哮喘組和健康對(duì)照組主要差異蛋白富集于激活T細(xì)胞和調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫應(yīng)答等生物進(jìn)程；肌動(dòng)蛋白結(jié)合、裂解酶、碳-碳裂解酶、細(xì)胞因子受體活性以及CARD蛋白結(jié)構(gòu)域等分子功能；中性粒細(xì)胞顆粒、Ficolins以及3級(jí)顆粒等細(xì)胞組成，詳見圖3。

圖3 GO富集分析A.生物進(jìn)程；B.分子功能；C.細(xì)胞組成

4.KEGG富集分析:KEGG是一個(gè)整合了基因組、化學(xué)和系統(tǒng)功能信息的數(shù)據(jù)庫。具有把從已經(jīng)完整測序的基因組中得到的基因目錄與更高級(jí)別的細(xì)胞、物種和生態(tài)系統(tǒng)水平的系統(tǒng)功能關(guān)聯(lián)起來的功能。重癥哮喘組和健康對(duì)照組誘導(dǎo)痰差異上調(diào)蛋白IL3RA/IL1R2/CXCR4/TNFSF14/IL18R1參與了細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用；ALDOC/HK3/TFRC參與了HIF-1信號(hào)通路; CXCR4/TNFSF14/IL18R1同時(shí)參與了病毒與細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用; IL3RA/TFRC/IL1R2同時(shí)參與了造血細(xì)胞系統(tǒng)；而ALDOC/HK3同時(shí)參與了果糖與甘露糖代謝，詳見圖4。

圖4 KEGG富集分析結(jié)果根據(jù)矯正后的P繪制氣泡圖以展現(xiàn)差異蛋白顯著富集的KEGG通路。縱坐標(biāo)為KEGG 通路，橫坐標(biāo)數(shù)值為經(jīng)校驗(yàn)后的P經(jīng)過lg負(fù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后的值

討 論

誘導(dǎo)痰技術(shù)應(yīng)用始于1958年,痰中豐富的細(xì)胞、蛋白質(zhì)和微生物成分可作為疾病嚴(yán)重性、急性發(fā)作、病情進(jìn)展及治療療效評(píng)價(jià)的標(biāo)志物。誘導(dǎo)痰技術(shù)作為哮喘實(shí)驗(yàn)室檢查的一種手段，因其無創(chuàng)性、安全性、可靠性及可重復(fù)性，在哮喘的診斷及表型確定中受到重視[13]。近年來，基因芯片技術(shù)廣泛用于揭示疾病發(fā)生、發(fā)展中遺傳改變。對(duì)哮喘誘導(dǎo)痰基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，有助于發(fā)掘治療哮喘的靶基因。

利用GEO2R對(duì)GSE137268基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得重癥哮喘與正常人氣誘導(dǎo)痰差異表達(dá)101個(gè)基因，其中70個(gè)上調(diào)基因，31個(gè)下調(diào)基因。通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，篩選出5個(gè)關(guān)鍵基因，包括JARID、HIST2H2AC、HIST2H2AA3、HIST2H2BE和PHC2。JARID2位于染色體6p22.3上，是組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的調(diào)節(jié)因子,在哮喘發(fā)生、發(fā)展中的作用未知[14]。HIST2H2AC、HIST2H2AA3和HIST2H2BE是核小體的核心成分。核小體將DNA包裹并壓縮成染色質(zhì)，限制了DNA進(jìn)入需要DNA作為模板的細(xì)胞機(jī)制。它們?cè)谵D(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA修復(fù)、DNA復(fù)制和染色體穩(wěn)定性中起著重要作用，可調(diào)節(jié)細(xì)胞因子產(chǎn)生及在哮喘發(fā)病、嚴(yán)重程度[15]。PHC2是造血干細(xì)胞的重要調(diào)節(jié)因子，哮喘患者造血干細(xì)胞動(dòng)員的具體機(jī)制目前仍不明確[16]。

富集分析提示T細(xì)胞參與的免疫應(yīng)答在重癥哮喘患者疾病發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。Th2亢進(jìn)被認(rèn)為是哮喘慢性氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[17, 18]。αβT分為CD4+αβT細(xì)胞和CD8+αβT兩種，主要在淋巴結(jié)之間巡邏、監(jiān)視，一旦受刺激被抗原遞呈細(xì)胞活化，前者可快速分化為效應(yīng)或調(diào)節(jié)T細(xì)胞，后者可分化為細(xì)胞毒性T和記憶T細(xì)胞。大部分過敏性哮喘氣道炎癥表現(xiàn)是由Th2型細(xì)胞因子調(diào)控的嗜酸粒細(xì)胞所介導(dǎo)的，本研究納入20例非嗜酸性粒細(xì)胞哮喘，其免疫機(jī)制有待進(jìn)一步深入研究。Ficolins是一種可溶分子，可與微生物表面上存在的碳水化合物相結(jié)合，且在凝集素補(bǔ)體激活途徑中充當(dāng)識(shí)別分子，在哮喘發(fā)生、發(fā)展中機(jī)制未明。

KEGG信號(hào)通路分析結(jié)果可以看到重癥哮喘組與健康對(duì)照組誘導(dǎo)痰基因表達(dá)存在差異。細(xì)胞因子是可溶性的細(xì)胞外蛋白或糖蛋白，哮喘疾病的發(fā)生、發(fā)展中多種細(xì)胞因子相互作用。細(xì)胞因子充當(dāng)細(xì)胞間重要的調(diào)節(jié)因子和動(dòng)員因子，參與先天性和適應(yīng)性免疫。在宿主防御、細(xì)胞生長、分化、死亡、血管生成以及發(fā)育和修復(fù)過程。缺氧誘導(dǎo)因子-1α是炎癥的主要調(diào)節(jié)者，研究觀察到在哮喘的肺泡巨噬細(xì)胞和肺實(shí)質(zhì)中上調(diào)，可能驅(qū)動(dòng)特定的哮喘表型[19]。研究顯示，美國兒童哮喘患病率(1980～1995年)不明原因的翻倍、持續(xù)攀升直至2013年的穩(wěn)定，可能與食品供應(yīng)中高果糖玉米糖漿的擴(kuò)散有關(guān)[20]。據(jù)估計(jì)，約30%～40%的成人哮喘發(fā)作與呼吸道病毒感染有關(guān)。大多數(shù)哮喘相關(guān)病毒包括呼吸道合胞病毒、鼻病毒和副流感病毒[21]。

綜上所述，通過生信分析篩選出的重癥哮喘誘導(dǎo)痰差異表達(dá)基因，部分在支氣管哮喘方面已有多項(xiàng)研究，但有些還有待于進(jìn)一步探索，如PHC2與造血細(xì)胞系統(tǒng)，以及補(bǔ)體系統(tǒng)重癥哮喘發(fā)生、發(fā)展中的作用。本實(shí)驗(yàn)利用生物信息學(xué)分析工具可預(yù)測哮喘誘導(dǎo)痰差異表達(dá)關(guān)鍵基因及通路，為哮喘的診治提供潛在的治療目標(biāo)。