lncRNA KIZ-AS1通過調控miR-1290/CDC73軸抑制膀胱癌細胞增殖和遷移

魯帥奇 楊凌博 秦帥鋒 張 寒 孫建濤

膀胱癌是泌尿系統中最常見的惡性腫瘤之一，致病因素包括抽煙、環境因素等[1,2]。膀胱癌患者男性多于女性，發生率隨年齡增長逐漸增高[3]。膀胱癌患者復發比例和轉移率較高，嚴重威脅患者生命健康[4]。長鏈非編碼RNA(lncRNA)和微小RNA(miRNA)均是非編碼RNA，參與調控腫瘤細胞的癌變、增殖、凋亡、遷移等過程，在腫瘤的發生和發展中起到關鍵作用[5,6]。miR-1290在口腔鱗狀細胞癌、胰腺癌、胃癌等多種腫瘤組織或血清中高表達，顯著促進腫瘤細胞的生長和轉移，與腫瘤患者的不良預后密切相關[7,8]。有研究顯示，miR-1290在膀胱癌細胞中表現為促癌因子作用[9]。KIZ-AS1是近年來發現的lncRNA，由562個核苷酸構成，目前關于KIZ-AS1在膀胱癌組織中的表達、作用及與miR-1290的靶向關系未見報道。本研究旨在觀察KIZ-AS1在膀胱癌組織和細胞系中的表達，探討KIZ-AS1對miR-1290/CDC73軸的調控作用及對膀胱癌細胞增殖和遷移的影響。

材料與方法

1.臨床標本：選取2017年9月～2020年12月鄭州大學附屬洛陽中心醫院泌尿外科膀胱癌根治性手術切除37例癌組織和癌旁組織，所有患者術前均未行放療和化療，本研究經鄭州大學附屬洛陽中心醫院醫學倫理學委員會同意，患者均簽署知情同意書。其中男性29例，女性8例，平均年齡為57.19±13.15歲；病理分級按照WHO(2004年)病理分級標準：1級7例，2級17例，3級13例；臨床分期按照國際抗癌聯盟(UICC)TNM分期標準：Ta～T125例，T2～T412例。所有組織術后立即于液氮中保存，所有標本均經筆者醫院兩名以上病理科醫生確診。

2.細胞與試劑：膀胱癌細胞系(RT-4、BIU-87、T24、5637)和膀胱上皮永生化細胞(SV-HUC-1)購自中國典型培養物保藏中心。KIZ-AS1慢病毒、陰性對照慢病毒、miR-1290 模擬物(mimic)、miR-NC mimic、pGL3-KIZ-AS1野生型質粒(KIZ-AS1-WT)與突變型質粒(KIZ-AS1-MUT)購自蘇州吉瑪基因股份有限公司。胎牛血清、RPMI1640培養基、DMEM培養基購自美國Hyclone公司。Lipofectamine 3000轉染試劑購自美國Invitrogen公司。qPCR試劑盒和MTT試劑盒購自南京凱基生物科技發展有限公司。雙熒光素酶報告基因試劑盒購自美國Promega公司。一抗(CDC73、cyclin D3、CDK2、α-tubulin、claudin-1、E-Cadherin)和辣根過氧化物酶標記二抗購自美國Cell Signaling Technology公司。

3.細胞培養和轉染：將SV-HUC-1細胞加入含體積分數10%胎牛血清的DMEM培養基中，將RT-4、BIU-87、T24、5637細胞加入含體積分數10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中，在37℃、5% CO2培養箱培養。將對數生長期的5637細胞分為對照組和KIZ-AS1組，根據感染復數為30，分別感染陰性對照慢病毒和KIZ-AS1慢病毒，于感染48h后收集各組細胞進行后續實驗。

4.qPCR檢測：TRIzol法提取膀胱癌組織和細胞系總RNA，反轉錄獲得cDNA。按照qPCR試劑盒說明書設定反應體系和反應參數，KIZ-AS1和CDC73 mRNA以GAPDH為內參，miR-1290以U6為內參。KIZ-AS1、miR-1290和CDC73 mRNA相對表達水平按照2-ΔΔCt方法計算。qPCR引物序列如下，KIZ-AS1正向引物：5′-TTTCCAGCATTTCCCATAGC-3′，反向引物：5′-CAGGTGGAATGTGGAACGA-3′；U6正向引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3′，反向引物：5′-TTTGCGTGTCATCCTTGCG-3′；miR-1290正向引物：5′-TGGATTTTTGGATCAGGG-3′，反向引物：5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′；GAPDH正向引物：5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′，反向引物：5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′；CDC73正向引物：5′-GAGAGAGTATGGAGGACA-CGAAC-3′，反向引物：5′-ATTTGGGGCAGGTCGCTGTTCA-3′。

5.生物信息學技術預測和雙熒光素酶報告基因實驗驗證：采用starBase v2.0數據庫預測KIZ-AS1互補結合的miRNA。將KIZ-AS1-WT、KIZ-AS1-MUT分別與miR-1290 mimic、miR-NC mimic采用Lipofectamine 3000轉染試劑共轉染至5637細胞。轉染48h，參照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒說明書，分別檢測海參熒光素酶發光強度和螢火蟲熒光素酶發光強度，兩者的比值代表KIZ-AS1與miR-1290的結合力。

6.Western blot法檢測：5637細胞感染48h后，加入細胞裂解液提取總蛋白，調節每組蛋白的上樣量，采用10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，進一步轉至硝酸纖維素膜，在5%脫脂牛奶中封閉，稀釋一抗：CDC73(1∶2000稀釋)、cyclin D3(1∶3000稀釋)、CDK2(1∶2000稀釋)、E-cadherin(1∶1000)、claudin-1(1∶1000)及α-tubulin(1∶3000)，在4℃冰箱內孵育過夜。加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2h。均勻滴加化學發光試劑，采用凝膠成像系統中曝光、拍照。

7.MTT法檢測：5637細胞感染48h后，按照1×103個/孔加入96孔板中，分別培養1、2、3、4、5天后加入濃度為5%的MTT溶液20μl，正常培養4h，吸出上清液，加入140μl二甲基亞砜，在振蕩器振蕩10min。采用酶標儀檢測波長450nm處的吸光度(A)值，實驗重復4次。

8.Transwell實驗檢測：5637細胞感染48h后，采用無血清培養基重懸5637細胞至2×105個/毫升，取180μl細胞懸液加入Transwell上室，加入600μl含體積分數10%胎牛血清的培養基至下室。培養箱培養24h，采用體積分數1%多聚甲醛固定10min，采用質量分數0.2%結晶紫染液染色10min，流水沖洗并風干，采用顯微鏡(×100)下拍照、計數進入膜下的細胞數，實驗重復4次。

結 果

1.膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達水平：如圖1所示，膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達分別為1.46±0.41和6.69±1.15，癌旁組織的KIZ-AS1表達是膀胱癌組織的4.58倍，顯著高于膀胱癌組織(P<0.01)。

圖1 膀胱癌組織和癌旁組織中KIZ-AS1表達水平

2.膀胱癌細胞和膀胱上皮永生化細胞細胞中KIZ-AS1表達水平：膀胱癌RT-4、BIU-87、T24、5637細胞中KIZ-AS1的表達分別為0.53±0.07、0.63±0.03、0.35±0.04、0.17±0.03，明顯低于膀胱上皮永生化細胞SV-HUC-1(1.04±0.14)，差異有統計學意義(P均<0.05，圖2)，5637細胞中KIZ-AS1表達水平最低(P<0.01)，選擇5637細胞進行后續研究。

圖2 膀胱上皮永生化細胞和膀胱癌細胞中KIZ-AS1表達水平與SV-HUC-1細胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.對照組和KIZ-AS1組5637細胞中KIZ-AS1的表達水平：qPCR結果顯示，KIZ-AS1組和對照組5637細胞中KIZ-AS1表達分別為11.29±1.87和1.06±0.25，差異有統計學意義(P<0.01)。

4.過表達KIZ-AS1抑制5637細胞增殖活力：MTT法結果顯示，從第2天起，KIZ-AS1組5637細胞增殖活力顯著低于對照組(P<0.05，圖3)。

圖3 MTT檢測KIZ-AS1對5637細胞增殖活力的影響與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01

5.過表達KIZ-AS1抑制5637細胞遷移能力：Transwell實驗顯示，對照組和KIZ-AS1組5637細胞遷移數分別為71.53±6.23個和26.87±3.88個，與對照組比較，過表達KIZ-AS1可明顯抑制5637細胞遷移(P<0.01，圖4)。

圖4 Transwell實驗檢測KIZ-AS1對5637細胞遷移能力的影響A.Transwell實驗檢測KIZ-AS1對膀胱癌細胞遷移的影響(結晶紫染色，×100)；B.細胞遷移數的半定量分析

6.生物信息學技術預測及雙熒光素酶報告基因實驗驗證KIZ-AS1的潛在機制：利用starBase v2.0數據庫預測miR-1290可能是KIZ-AS1的靶基因，預測序列見圖5。雙熒光素酶報告基因實驗結果顯示，與miR-NC組比較，miR-1290組KIZ-AS1-WT細胞中相對熒光素酶活性顯著降低(P<0.01)，KIZ-AS1-MUT細胞中相對熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05，圖6)。

圖5 生物信息學技術預測KIZ-AS1的潛在機制

圖6 雙熒光素酶報告基因實驗驗證KIZ-AS1的潛在機制

7.過表達KIZ-AS1的5637細胞中miR-1290和CDC73 mRNA表達變化：qPCR檢測顯示，對照組和KIZ-AS1組5637細胞miR-1290的表達分別為1.11±0.15和0.40±0.09，過表達KIZ-AS1顯著下調miR-1290的表達(P<0.01)。對照組和KIZ-AS1組5637細胞CDC73 mRNA的表達分別為1.02±0.17和4.94±0.90，過表達KIZ-AS1顯著上調CDC73 mRNA的表達(P<0.01)。

8.過表達KIZ-AS1促進CDC73蛋白表達：Western blot法檢測結果顯示，過表達KIZ-AS1后5637細胞中CDC73蛋白表達明顯增加，細胞增殖蛋白如cyclin D3、CDK2表達降低，細胞遷移蛋白如claudin-1、E-cadherin表達明顯增加，提示5637細胞的增殖和遷移能力明顯降低(圖7)。

圖7 Western blot法檢測CDC73蛋白及細胞功能蛋白表達情況

討 論

lncRNA是一大類長度>200個核苷酸的內源性單鏈RNA，已被證明在各種惡性腫瘤組織或外周血清中異常上調或下調，表現為促癌因子或抑癌因子作用[10～12]。伴隨測序技術的不斷發展，越來越多的lncRNA被發現在膀胱癌細胞中發揮重要功能[13, 14]。Zhang等[15]研究表明，在膀胱癌組織中發現lncRNA BCAR4表達升高，沉默lncRNA BCAR4可通過調節miR-370-3p表達，抑制膀胱癌5637和T24細胞的增殖并誘導細胞凋亡。He等[16]研究表明，lncRNA ZNF503-AS1在膀胱癌組織中降低，過表達ZNF503-AS1可通過與轉錄因子GATA6結合，減弱膀胱癌細胞的增殖、侵襲和遷移能力，促進膀胱癌細胞凋亡。本研究結果發現，與癌旁組織比較，膀胱癌組織中KIZ-AS1相對表達水平顯著降低；與膀胱上皮永生化細胞比較，膀胱癌細胞系中KIZ-AS1相對表達水平明顯降低；過表達KIZ-AS1可抑制膀胱癌5637細胞的增殖和遷移，提示KIZ-AS1低表達可能與膀胱癌的發生、發展有關，KIZ-AS1在膀胱癌細胞中可能發揮抑癌因子作用。

lncRNA主要通過競爭性結合miRNA應答元件，降低miRNA表達水平，阻止miRNA與靶基因mRNA的結合，促進靶基因mRNA的表達[17, 18]。本研究利用starBase v2.0預測顯示，KIZ-AS1與miR-1290可能存在結合位點，雙熒光素酶報告基因實驗進一步證實了KIZ-AS1和miR-1290的靶向關系。近年來研究證實，miR-1290高表達與胰腺癌、結直腸癌的發生和發展有關，外周血miR-1290高表達是腫瘤患者預后不良的重要標志物[19, 20]。Wang等[9]研究表明，miR-1290在膀胱癌組織和細胞系中表達明顯上調，CDC73基因在膀胱癌組織和細胞系中低表達，miR-1290通過靶向抑制CDC73基因表達，促進膀胱癌細胞的增殖和轉移。qPCR和Western blot法檢測結果顯示，過表達KIZ-AS1后，miR-1290表達明顯降低，CDC73基因表達明顯增加，表明KIZ-AS1通過競爭性結合miR-1290應答元件，促進CDC73基因表達，抑制膀胱癌的發生和發展。Western blot法檢測結果顯示，過表達KIZ-AS1后，細胞增殖蛋白如cyclin D3、CDK2表達減少，細胞遷移蛋白如claudin-1、E-cadherin表達明顯增加，表明5637細胞增殖和遷移能力明顯降低。

綜上所述，膀胱癌組織和細胞系中KIZ-AS1表達下調，KIZ-AS1通過抑制miR-1290表達，間接增高CDC73基因表達，進而抑制膀胱癌5637細胞的增殖和遷移。KIZ-AS1/miR-1290/CDC73軸的研究為膀胱癌診斷和靶向治療提供了一定的實驗依據。