CT-707對缺氧微環境下肝癌細胞能量代謝和細胞周期的影響及作用機制

姚紅兵 吳嘉興 郭 威 文雪霖 蔣建暉 劉翔峰

肝細胞癌(肝癌)是常見的惡性腫瘤，缺氧是惡性腫瘤微環境的主要特征之一，肝癌細胞在缺氧環境下可通過增強糖酵解代謝方式，維持細胞增殖的能量需求，從而促進肝癌進程[1,2]。糖原合成激酶(glycogen synthase kinase-3β, GSK-3β)介導的信號通路對細胞的增殖、分化及能量代謝具有重要作用，其活性受到Akt的調控。黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一種胞質非受體蛋白酪氨酸激酶，與腫瘤的多種生物學行為密切相關，磷酸化的FAK可通過結合PI3K/Akt促進癌細胞的增殖[3]。研究發現，FAK在肝癌組織中異常表達及活化，并與肝癌進展有顯著相關性，可作為肝癌藥物開發的新靶標[4]。多激酶抑制劑CT-707是一種新型FAK抑制劑，可通過抑制FAK的磷酸化發揮良好的抗腫瘤活性[5]。筆者前期研究已證實CT-707在肝癌動物模型中可抑制肝癌細胞的增殖以及腫瘤形成，促進癌細胞的凋亡[6]。故本研究結合肝癌細胞在缺氧微環境中的代謝特點，基于PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，旨在進一步探討新型FAK抑制劑CT-707的抗肝癌作用及機制。

材料與方法

1.試驗材料：人肝癌HepG2細胞株購自中國科學院上海細胞庫，使用含10%胎牛血清及1%雙抗的改良Eagle培養基(DMEM)培養基，于5%CO2、37℃培養箱中常規培養。6周齡BALB/c裸鼠購自廣西醫科大學實驗動物中心，在SPF級條件下飼養。CT-707購自美國MCE公司；DMEM、胎牛血清購自美國Gibco公司；cyclin D1、cyclin E、p-FAK、FAK、PI3K、Akt、p-GSK-3β、GSK-3β、PCNA、β-actin抗體購自英國Abcam公司；p-PI3K、p-Akt抗體購自美國CST公司；羊抗鼠二抗、羊抗兔二抗購自美國Sigma公司；HE染色試劑盒、己糖激酶(HK)試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒購自北京Solarbio公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購自南京建成生物；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物公司。

2.HepG2缺氧培養及分組：將HepG2細胞接種于6孔板中，每孔細胞數2×105，參照文獻[5,7]按CT-707劑量范圍(0～6μmol/L)分為control(對照)組以及處理組[CT-707高(6μmol/L)、中(3μmol/L)、低(1.5μmol/L)劑量組]。根據實驗分組，處理組分別加入相應劑量的含藥DMEM，對照組則加入無藥DMEM，各組均于37℃缺氧培養箱(2%O2、5%CO2、93%N2)中培養48h。

3.CCK8：將對數生長期的HepG2接種于96孔板中，根據分組進行相應處理，并設置空白對照(空白組)，培養48h后，每孔加入10μl CCK8工作液，37℃培養2h，酶標儀檢測450nm波長處的吸光度(A)值，計算細胞存活率：細胞活性(%)=(A處理組-A空白組) /(A對照組-A空白組)×100%。

4.HK酶活性檢測：收集各組細胞，培養基稀釋為5×106/ml，加入1ml提取液，冰浴超聲提取，重復操作多次使細胞充分破碎，8000×g4℃離心10min，取上清待測。取50μl待測液于EP管中，加入950μl工作液，混勻后快速移至微量石英比色皿中，紫外分光光度儀測定340nm波長下吸光度A1。將反應液置于37℃中水浴2min，立即測定吸光度A2。計算HK酶活[U/(gpro)]=(A2-A1)/毫摩爾消光系數/反應時間/比色光徑×(反應液總體積/取樣量)×1000。

5.LDH含量檢測：胰酶消化收集各組HepG2，進行計數，離心棄上清，按5×106個細胞加入1ml提取液的比例加入提取液，冰浴超聲波提取2min，8000×g4℃離心10min，根據LDH試劑盒試劑盒說明書配置標準品和樣品，按步驟加入樣本和基質緩沖液、輔酶Ⅰ，37℃反應15min，加入2，4-二硝基苯肼，漩渦混勻，37℃孵育15min，加入NaOH溶液室溫放置3min，440nm波長，1cm光徑比色，按標準曲線計算LDH含量。

6.Western blot法檢測：各組HepG2用預冷的PBS洗滌2次，RIPA裂解液冰上裂解30min，低溫離心取上清，行BCA蛋白定量。每孔蛋白上樣量為20μg，SDS-PAGE電泳，濕法轉膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1h，一抗4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次。二抗室溫孵育1h，洗膜3次，用ECL檢測液發光顯影定影后，Image J分析灰度值。

7.裸鼠皮下成瘤及藥物治療：將對數生長期的HepG2胰酶消化收集，1000×g離心5min，取細胞沉淀重懸，制成細胞濃度為2.5×107/ml懸液。于無菌環境下，采用1ml注射器抽取0.2ml細胞懸液，在常規消毒的裸鼠腋部皮膚進行細胞懸液接種。根據實驗動物3R原則，將接種HepG2細胞懸液的裸鼠隨機分為4組，分為模型組和CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)劑量組，每組8只，CT-707按照劑量腹腔注射給藥，每天兩次，模型組則注射等量0.9%氯化鈉溶液[7]。給藥14天后處死動物，取腫瘤組織進行稱重及體積測量。

8.HE染色：腫瘤組織于4%多聚甲醛中固定，行石蠟切片，根據HE試劑盒說明進行染色，封片，鏡檢，觀察組織病理結構。

9.免疫組化：取各組腫瘤組織切片進行免疫組化染色。采用微波抗原修復后，滴加3% H2O2以去除內源性過氧化物酶活性，蒸餾水洗凈。滴加封閉液室溫孵育，一抗4℃過夜孵育。棄去一抗，PBS沖洗，滴加二抗，室溫孵育20min，棄去二抗。滴加辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，室溫孵育20min，PBS洗凈后滴加DAB顯色。著色后浸入水中終止反應，自來水反復沖洗后，蘇木精復染；梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并拍照。Image J軟件分析PCNA的陽性表達。

結 果

1.缺氧環境下CT-707對肝癌細胞活性、能量代謝及細胞周期的影響：與對照組比較，CT-707高、中、低劑量組HepG2細胞活性下降，HK活性及LDH含量顯著下調，細胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E顯著下調(P<0.05)，中、高劑量組的效應明顯優于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組間結果比較，差異無統計學意義(P<0.05，圖1、圖2)。

圖1 各組細胞活性、HK活性及LDH含量檢測結果A.細胞活性；B.HK活性；C.LDH含量。與對照組比較，*P<0.05；與CT-707(1.5μmol/L) 組比較，#P<0.05

圖2 各組細胞中cyclin D1和cyclin E的蛋白表達與對照組比較，*P<0.05；與CT-707(1.5μmol/L) 組比較，#P<0.05

2.缺氧環境下CT-707對FAK/PI3K信號通路的影響：與對照組比較，CT-707高、中、低劑量組HepG2中FAK、PI3K、GSK-3β、p-FAK/FAK、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-GSK-3β/GSK-3β水平均明顯下調，中、高劑量組的效應明顯優于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組間結果比較，差異無統計學意義(P>0.05)，各組Akt蛋白表達比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖3)。

圖3 FAK/PI3K信號通路關鍵因子的Western blot法檢測結果

3.CT-707對HepG2裸鼠移植瘤的抑制作用：與模型組比較，CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)劑量組瘤質量、瘤體積明顯下降(P<0.05)，其中中、高劑量組的效應明顯優于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組間結果比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖4)。

圖4 裸鼠移植瘤質量和體積A.移植瘤質量；B.移植瘤體積；與模型組比較, *P<0.05; 與CT-707(25 mg/kg) 組比較, #P<0.05

4.CT-707對HepG2裸鼠移植瘤細胞增殖及壞死的影響：采用HE染色檢測HepG2裸鼠移植瘤細胞壞死情況。鏡下觀察模型組細胞核清晰可見，細胞排列整齊致密；CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)劑量組細胞排列松散，部分細胞核消失，出現壞死區域，且隨著CT-707劑量增加，壞死區域增加，細胞核消失增加。采用免疫組化檢測HepG2裸鼠移植瘤中PCNA的表達情況，結果表明，與模型組比較，CT-707高(100mg/kg)、中(50mg/kg)、低(25mg/kg)劑量組PCNA陽性細胞表達率均顯著降低(P<0.05)，中、高劑量組的效應明顯優于低劑量組(P<0.05)，中、高劑量組間結果比較，差異無統計學意義(P>0.05，圖5、圖6)。

圖5 各組移植瘤的HE染色比較(×400)A.模型組；B.CT707(25mg/kg)組；C.CT707(50mg/kg)組；D.CT707(100mg/kg)組

圖6 各組移植瘤中PCNA的陽性表達比較(×400)與模型組比較, *P<0.05; 與CT-707(25mg/kg) 組比較, #P<0.05

討 論

肝癌發病隱匿且病情進展迅速，患者確診時大多已在進展期或晚期。肝癌細胞的快速增殖，是導致肝癌病情進展迅速的重要原因[8]。惡性腫瘤增殖過程伴隨高速代謝，在快速生長的同時，氧耗劇增，且腫瘤內新生血管滯后引起血氧供應不足，從而造成腫瘤組織局部缺氧，此時癌細胞可通過增強糖酵解，并轉而依賴糖酵解途徑作為主要能量供給來源，適應缺氧微環境。腫瘤在缺氧微環境中的持續增殖，是多種蛋白作用的結果，其中缺氧可誘導FAK激活，FAK可通過PI3K/Akt等多條信號通路參與增殖和腫瘤的形成[9]。CT-707是一種新型多激酶抑制劑，可抑制FAK、ALK和Ply2蛋白的活性，研究表明，CT-707在缺氧環境下對HepG2具有更強的增殖抑制效果，但其作用機制尚未完全闡明[7]。因此，本研究通過建立HepG2缺氧模型及皮下成瘤動物模型，進一步觀察CT-707對HepG2糖酵解途徑及細胞周期的影響，探討其抗肝癌細胞增殖的作用機制。

糖酵解代謝模式為癌細胞的增殖提供了物質基礎，使得癌細胞在缺氧等環境中存活和增殖[10]。HK是糖酵解途徑的關鍵酶，可將葡萄糖轉化為6-磷酸葡萄糖，在缺氧條件下為癌細胞提供碳源，HK在包括肝癌在內的癌組織中大量表達，可促進癌細胞的增殖及糖酵解[11]。LDH是催化糖酵解的限速酶之一，可將丙酮酸轉化為乳酸排至胞外。LDH在多種腫瘤組織中表達升高，其表達與腫瘤組織的大小顯著相關，可作為腫瘤診斷的標志物[12]。此外，癌細胞通過調控細胞周期的時相分布從而實現快速增殖。細胞周期蛋白的表達和調控，是控制細胞周期轉換，影響增殖的關鍵因素。

細胞周期蛋白cyclin D1、cyclin E可引起DNA復制，推動細胞周期由G1期進入S期，從而促進癌細胞的增殖[13]。本研究發現，CT-707在缺氧培養條件下抑制HepG2細胞增殖的同時，可降低HK和LDH的含量，抑制cyclin D1、cyclin E的表達，表明CT-707可阻斷缺氧環境下肝癌細胞糖酵解代謝途徑，并誘導細胞周期阻滯，具有顯著的抗肝癌細胞增殖的效應。

cyclin D1、cyclin E及HK、LDH的表達受GSK-3β的調控[14, 15]。GSK-3β通過介導細胞內多種信號轉導通路，磷酸化使底物蛋白失活發揮負性調節作用，是細胞內糖代謝、細胞增殖、分化及凋亡調控的關鍵因子[16]。研究發現，GSK-3β在肝癌組織中的表達水平低于正常肝組織及癌旁組織，其表達與組織病理學評分、腫瘤分級相關[17]。PI3K/Akt是GSK-3β上游信號通路，Akt可磷酸化GSK-3β Ser9位點，抑制GSK-3β的活性，促進糖酵解及細胞周期蛋白的表達，進而促進癌細胞的增殖[18]。抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號通路是多種藥物的抗腫瘤作用機制，而FAK可參與調控PI3K/Akt信號通路，因此推測FAK抑制劑CT-707可通過抑制PI3K/Akt/GSK-3β發揮抗肝癌作用。本研究發現CT-707可顯著下調缺氧培養下HepG2中p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt和p-GSK-3β/ GSK-3β表達水平，且CT-707中、高濃度時作用更明顯，表明CT-707抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號通路可能是其抑制肝癌細胞增殖的關鍵機制。

為進一步研究CT-707對肝癌細胞增殖的影響及機制，本研究對皮下種植HepG2的裸鼠給予CT-707治療，發現CT-707可顯著減小移植瘤的體積和質量，破壞癌組織結構，表明CT-707具有顯著的抗肝癌作用。PCNA是DNA復制的必須物質，與細胞中DNA合成及細胞周期密切相關。PCNA的表達從G1期開始升高，S期表達達到高峰，到G2期逐漸下降，是反映細胞增殖的主要生物學指標[19]。本研究發現,CT-707可顯著下調PCNA陽性細胞比例，進一步從體內研究證實CT-707可引起肝癌細胞周期阻滯，抑制細胞增殖活性，從而發揮抗肝癌作用。

綜上所述，本研究發現FAK抑制劑CT-707在缺氧環境下可通過抑制PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，阻斷肝癌細胞糖酵解代謝途徑，并誘導細胞周期阻滯，抑制肝癌細胞增殖及腫瘤生長，表明CT-707作為一種FAK靶向抑制劑具有良好的抑癌作用，可能是潛在的腫瘤靶向藥物，值得深入研究。