miR-3614-5p在卵巢癌細胞中的表達及對卵巢癌細胞增殖和遷移的影響

巫夢雪 杜薇娜 王 曼 熊國平

卵巢癌是最常見的女性癌癥類型之一，治療手段主要包括手術治療、放療、免疫治療、化療[1]。盡管近年來卵巢癌的診斷和治療得到了較大的發展，由于其淋巴結轉移率很高，多數患者療效不佳，5年生存率很低[2]。篩選合適的分子標志物和治療靶點是監測和干預卵巢癌發生、進展的關鍵。微小RNA(miRNA)由18～25個核苷酸構成的內源性小分子RNA，在基因的轉錄過程發揮重要調控作用[3,4]。多項研究顯示，惡性腫瘤組織和細胞中均存在miRNA差異表達，miRNA通過抑制抑癌基因或癌基因的翻譯過程，影響腫瘤細胞的凋亡、遷移、耐藥性、增殖等生物學行為[5,6]。miR-3614-5p屬于miR-3614家族，是定性明確的抑癌基因[7,8]。Li等[7]研究發現，非小細胞肺癌組織中miR-3614-5p的表達水平降低，miR-3614-5p能夠抑制非小細胞肺癌細胞的增殖和轉移。目前，有關miR-3614-5p在卵巢癌中的研究很少。本研究旨在探討miR-3614-5p在卵巢癌細胞系中的表達，觀察miR-3614-5p對卵巢癌細胞增殖和遷移能力的影響，明確miR-3614-5p參與卵巢癌發生、發展的機制。

材料與方法

1.細胞與試劑：人卵巢癌細胞系(SKOV-3、OVCAR-3、A2780、HO-8910、OC3)和人正常卵巢上皮細胞IOSE80購自美國標準培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)。miR-3614-5p模擬物、miR-NC模擬物、雙熒光素酶報告基因載體psiCHECK2(GNAI2-m、GNAI2-w)、PCR引物購自上海吉瑪生物制藥有限公司。一抗GNAI2、β-tubulin、p-AKT、RHEB、p-mTOR和辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國CST公司。CCK-8試劑盒購自美國Sigma公司。RPMI 1640培養基、DMEM/F12培養基、胎牛血清和BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自美國Amresco公司。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)相關試劑盒購自日本TaKaRa公司。Transwell小室購自美國Corning公司。Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司。

2.細胞培養和細胞轉染：SKOV-3、A2780、HO-8910和IOSE80細胞置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培養基中，OVCAR-3、OC3細胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在體積分數5%CO2、37℃孵箱中培養。取對數生長期的OVCAR-3細胞，嚴格按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書進行轉染，分別將miR-3614-5p模擬物(miR-3614-5p組)、miR-NC模擬物(對照組)轉染至OVCAR-3細胞，培養48h后，收集細胞采用qRT-PCR檢測轉染效率。

3.qRT-PCR檢測miR-3614-5p和GNAI2信使RNA(mRNA)相對表達量：TRIzol法提取收集卵巢癌細胞系和正常卵巢上皮細胞總RNA，每個樣本選擇2μg總RNA進行反轉錄，以U6作為對照，qRT-PCR檢測miR-3614-5p相對表達量；以GAPDH作為對照，qRT-PCR檢測GNAI2 mRNA相對表達量。qRT-PCR引物序列如下，U6上游引物為5′- CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物為5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。miR-3614-5p上游引物為5′- AACAAGCCACTTGGATCTGAAGG -3′，下游引物為5′- CAGTGCAGGGTCCGAGGT -3′；GNAI2上游引物為5′- TACCGGGCGGTTGTCTACA-3′，下游引物為5′- GGGTCGGCAAAGTCGATCTG-3′；GAPDH上游引物為 5′- ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物為5′- GCCATCACGCCACAGTTTC-3′。采用2-ΔΔCt方法計算miR-3614-5p和GNAI2 mRNA相對表達量。

4.生物信息學預測結合雙熒光素酶報告基因法驗證miR-3614-5p的靶基因：利用miRecords和DIANA-microT在線預測軟件預測miR-3614-5p可能的靶基因。將對數生長期的OVCAR-3細胞接種于24孔板，通過Lipofectamine 2000分別將GNAI2-m和miR-NC、GNAI2-w和miR-NC、GNAI2-m和miR-3614-5p、GNAI2-w和miR-3614-5p瞬時轉染OVCAR-3細胞，轉染48h。根據雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作，通過多功能酶標儀讀取各組的熒光值，計算各組的相對熒光素酶活性。

5.Western blot法檢測GNAI2蛋白和和AKT/mTOR信號通路蛋白表達變化：取各組轉染48h的OVCAR-3細胞，提取總蛋白并測定蛋白濃度。每組上樣35μg蛋白于SDS-PAGE凝膠進行電泳分離，采用半濕法將蛋白轉到聚偏氟乙烯膜，在2%脫脂牛奶中室溫封閉4h。稀釋一抗GNAI2(1∶3000稀釋)、β-tubulin(1∶3000稀釋)、p-AKT(1∶2000稀釋)、RHEB(1∶2000)及p-mTOR(1∶2000)，添加一抗并在4℃孵育15h。稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)，添加二抗并在室溫孵育1.5h。配制化學發光試劑，在化學發光成像系統中曝光、采集圖像。

6.CCK-8檢測OVCAR-3細胞增殖能力：取各組轉染48h的OVCAR-3細胞，以每孔2×103個細胞(150μl)接種到96孔板，每組5個復孔。加入15微升/孔CCK-8溶液，培養箱內孵育3h，通過多功能酶標儀讀取每孔在450nm波長處的吸光度(A)值。按照CCK-8試劑盒說明書連續5天進行檢測，繪制OVCAR-3細胞生長曲線。

7.Transwell遷移實驗檢測OVCAR-3細胞遷移能力：取各組轉染48h的OVCAR-3細胞，取4×105個/毫升的OVCAR-3細胞以150μl接種于Transwell小室上室，在下室添加含10%胎牛血清的培養基750μl，培養箱內孵育24h。采用棉棒擦去上室上表面的細胞，使用甲醇溶液固定20min，使用0.1%的結晶紫溶液染色15min，于倒置顯微鏡下計數4個單獨視野下的染色細胞數，其均值代表OVCAR-3細胞的遷移能力。

結 果

1.miR-3074-5p表達水平與卵巢癌患者生存期的關系：與miR-3074-5p表達較低的卵巢癌患者比較，miR-3074-5p表達較高的患者生存期較長(P<0.05,圖1)。

圖1 miR-3074-5p表達水平與卵巢癌患者生存期的關系

2.miR-3614-5p在卵巢癌細胞系和正常卵巢上皮細胞中的表達：qRT-PCR檢測結果顯示，卵巢癌細胞(SKOV-3、OVCAR-3、A2780、HO-8910、OC3)及正常卵巢上皮細胞IOSE80中miR-3614-5p的表達分別為0.58±0.02、0.22±0.03、0.40±0.06、0.69±0.05、0.59±0.09和1.01±0.09。與IOSE80細胞比較，miR-3614-5p在卵巢癌細胞系表達水平顯著降低(P<0.01)，miR-3614-5p表達最低的細胞是OVCAR-3細胞(P<0.01，圖2)。

圖2 miR-3614-5p在卵巢癌細胞系和正常卵巢上皮細胞中的表達與IOSE80細胞比較，*P<0.05，**P<0.01

3.轉染后OVCAR-3細胞中miR-3614-5p表達：miR-3614-5p組和對照組OVCAR-3細胞中miR-3614-5p表達分別為9.96±1.04和0.98±0.16，miR-3614-5p組是對照組的10.16倍(P<0.01)。

4.miR-3614-5p對OVCAR-3細胞增殖能力的影響：CCK-8法檢測結果顯示，與對照組比較，miR-3614-5p組OVCAR-3細胞在第2、3、4、5天的吸光度值明顯降低(P<0.05，圖3)。

圖3 miR-3614-5p對OVCAR-3細胞增殖能力的影響與對照組比較，*P<0.05

5.miR-3614-5p對OVCAR-3細胞遷移能力的影響：Transwell遷移實驗顯示，miR-3614-5p組和對照組穿膜細胞數分別為30.53±9.03個和102.70±12.87個，miR-3614-5p組顯著少于對照組(P<0.01，圖4)。

圖4 miR-3614-5p對OVCAR-3細胞遷移能力的影響A.Transwell實驗鏡下圖(結晶紫染色，×100)；B.Transwell實驗定量結果

6.生物信息學軟件預測miR-3614-5p的靶基因：利用miRecords和DIANA-microT在線預測軟件對miR-3614-5p的靶基因進行預測，發現miR-3614-5p可能與GNAI2 mRNA的3′非翻譯區存在潛在結合位點(圖5)。

圖5 miR-3614-5p與GNAI2 mRNA3′非翻譯區的序列配對分析

7. 雙熒光素酶報告基因法驗證miR-3614-5p的靶基因：雙熒光素酶報告基因法顯示，GNAI2-w+miR-NC組和GNAI2-w+miR-3614-5p組相對熒光酶活性分別是1.01±0.12和0.23±0.07，轉染miR-3614-5p能明顯降低轉染GNAI2-w的OVCAR-3細胞的相對熒光素酶活性(P<0.01,圖6)。

圖6 雙熒光素酶報告基因法驗證miR-3614-5p的靶基因

8.miR-3614-5p對OVCAR-3細胞中GNAI2 mRNA表達的影響：qRT-PCR法檢測結果顯示，miR-3614-5p組和對照組OVCAR-3細胞中GNAI2 mRNA表達分別為0.24±0.06和1.03±0.09，高表達miR-3614-5p顯著抑制GNAI2 mRNA的表達(P<0.01)。

9.高表達miR-3614-5p對GNAI2蛋白和AKT/mTOR信號通路蛋白表達的影響：Western blot法檢測結果顯示，高表達miR-3614-5p后，GNAI2蛋白表達下調，AKT/mTOR信號通路蛋白如p-AKT、RHEB、p-mTOR的表達明顯降低，AKT/mTOR信號通路轉導被抑制(圖7)。

圖7 高表達miR-3614-5p對OVCAR-3細胞GNAI2蛋白和AKT/mTOR信號通路蛋白表達的影響

討 論

miRNA在真核細胞生物體內高度保守，其在細胞分化、發育及生長過程起到關鍵調節作用[9]。近年來研究顯示，miRNA在卵巢癌組織和細胞中表達異常，與卵巢癌的形成密切相關[10～12]。Zeng等[13]研究發現，丙泊酚可以上調卵巢癌細胞系中miR-125a-5p的表達，miR-125a-5p高表達可顯著抑制卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲。Xiao等[14]研究發現，let-7e是卵巢癌患者無進展生存期和總生存期的獨立預后因素，let-7e表達失調可通過影響DNA雙鏈斷裂修復促進順鉑的耐藥，恢復let-7e表達可增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感度。Han等[8]研究發現，miR-3614-5p在結直腸癌組織中表達降低，其低表達與結直腸癌患者TNM分期、腫瘤類型、淋巴浸潤顯著相關，miR-3614-5p低表達的患者總生存率較低。

本研究比較了卵巢癌細胞系和正常卵巢上皮細胞miR-3614-5p的表達，結果顯示，卵巢癌細胞系中miR-3614-5p的表達明顯低于正常卵巢上皮細胞，說明miR-3614-5p可能參與了卵巢癌的發生和發展。本研究進一步觀察了miR-3614-5p在卵巢癌中的生物學功能，結果顯示，miR-3614-5p組卵巢癌細胞的增殖水平和遷移能力降低，提示miR-3614-5p在卵巢癌細胞中表現為抑癌作用。miRNA主要以堿基互補配對的方式結合靶基因mRNA，并且依據互補配對的程度，抑制mRNA的翻譯或者直接降解mRNA[15,16]。

本研究應用miRecords和DIANA-microT在線預測軟件預測發現，miR-3614-5p與G蛋白α抑制劑2(G protein alpha inhibiting activity polypeptide 2，GNAI2)mRNA3′非翻譯區存在潛在結合位點。GNAI2蛋白是一種G蛋白家族抑制型蛋白，通過降低腺苷酸環化酶活性，影響多種信號通路的轉導[17]。GNAI2蛋白已被公認為促癌蛋白，結腸癌、前列腺癌、食管鱗癌等多種惡性腫瘤中均存在GNAI2蛋白的陽性表達，且GNAI2蛋白在低分化腫瘤組織中的表達高于中高分化組織，GNAI2蛋白表達陽性的患者臨床分期較晚、淋巴結轉移率較高、生存率較低[18,19]。Fu等[20]研究發現，GNAI2蛋白在卵巢癌細胞系中表達明顯增加，GNAI2蛋白能夠通過促進AKT/mTOR信號通路轉導，促進卵巢癌細胞的增殖，沉默GNAI2表達，抑制卵巢癌細胞的增殖。雙熒光素酶報告基因實驗證明miR-3614-5p可互補結合GNAI2 mRNA。本研究中，對OVCAR-3細胞轉染miR-3614-5p模擬物，miR-3614-5p能夠在mRNA和蛋白水平抑制GNAI2的表達。miR-3614-5p負性調控GNAI2蛋白活性后，AKT/mTOR信號通路蛋白如p-AKT、RHEB、p-mTOR的表達明顯降低，AKT/mTOR信號通路轉導被抑制。

綜上所述，miR-3614-5p在卵巢癌細胞系中表達降低，miR-3614-5p通過作用于GNAI2基因mRNA對該基因進行靶向負調控，阻滯AKT/mTOR信號通路轉導，抑制卵巢癌OVCAR-3細胞的增殖和遷移過程。miR-3614-5p可能為卵巢癌的miRNA靶向治療提供新的靶點。