姜酮在博來霉素誘導小鼠肺纖維化中的保護作用及機制研究

胡曉晴 熊 娟 范國華 周 倩

特發性肺纖維化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一種進行性且可致死的慢性肺部疾病。IPF患者長期預后差，在全球范圍內的發生率逐年升高[1]。IPF以肺泡上皮細胞損傷、不受控制的肌成纖維細胞增殖和異常的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)沉積為病理特征，最終可導致肺泡壁的破壞和呼吸衰竭[2]。目前，IPF發生的分子機制尚未完全明確，研究表明肺組織中氧化和抗氧化失衡可加重在IPF進展。轉錄因子紅系2相關因子2(nuclear factor-erythroid 2-related factor 2, Nrf2)是機體重要對的轉錄因子，可轉錄激活多種抗氧化基因，同時還可抑制多種纖維化疾病的進展[3，4]。因此，探尋可激活NRF2的藥物對今后IPF的預防和治療具有重要意義。

姜酮(zingerone，ZO)是一種無毒且價格低廉的天然化合物，主要從調味植物生姜中提取，已被證實具有多種藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗癌和抗糖尿病活性[5～7]。既往研究表明，ZO可以通過激活NRF2減輕壓力負荷過載誘導的小鼠心肌纖維化[8]。但ZO是否可以改善BLM誘導小鼠肺纖維化目前尚未有研究報道。本研究擬通過氣管注射博來霉素(bleomycin，BLM)的方式以建立小鼠IPF模型, 同時觀察不同劑量的ZO干預對IPF小鼠肺纖維化的影響并探討潛在機制。

材料與方法

1.材料: 博來霉素(bleomycin，BLM，純度: 99.2%，批號：M1180)購自邁瑞達科技(北京)有限公司；姜酮(純度: ≥98%，批號：CAS122-48-5)購自上海融禾醫藥科技發展有限公司；一抗：GAPDH(批號：ab8245)、collagenⅠ(批號：ab34710)、α-SMA(批號：ab7817)、NRF2(批號：ab62352)、羊抗兔 IgG (批號: ab124055)購自英國Abcam公司；蘇木精-伊紅(HE)染色液試劑盒購自深圳市達科為生物工程有限公司；馬松染色試劑盒購自武漢卡諾斯科技有限公司。

2.實驗動物及IPF小鼠模型的建立: 本實驗中所使用的實驗動物為雄性C57BL/6小鼠(8～10周)，體質量為235～300g，購自湖北省預防醫學科學院動物中心。根據隨機數字表法將 40 只小鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量ZO治療組及高劑量ZO治療組，每組10只。模型組、低劑量ZO治療組及高劑量ZO治療組小鼠接受氣管單次注射BLM(5mg/kg)以構建肺纖維化模型。低劑量ZO治療組及高劑量ZO治療組小鼠于BLM注射24h后分別給予10mg/kg和20mg/kg ZO灌胃，每4天1次。28天后，通過頸椎脫臼法處死小鼠后，留取雙側肺組織。

3.HE染色: 取小鼠右肺組織，用10%甲醛溶液固定并脫水，隨后用石蠟包埋并切片。將肺石蠟切片于二甲苯和梯度乙醇中脫蠟并水化，蘇木精染細胞核，伊紅染細胞質，脫水封片后在光學顯微鏡下觀察各組肺組織的病理形態。

4.Masson染色: 將Weigert鐵蘇木精A液和Weigert鐵蘇木精B液等量混合獲得Weigert鐵蘇木精染色液，使用Weigert 鐵蘇木精染色液染色。酸性乙醇分化后，使用藍化液藍化。隨后使用麗春紅品紅染色液染色并使用苯胺藍染色液復染，脫水后在光學顯微鏡下觀測肺纖維化水平，并根據Ashcroft評分表對各組小鼠肺纖維化進行評分。

5.ELISA試劑盒檢測MDA，SOD及羥脯氨酸: 取凍存肺組織40～50mg，將肺組織研磨成勻漿后，根據試劑盒說明書上的步驟分別檢測各組小鼠肺組織中MDA、SOD和羥脯氨酸的含量。

6.Western blot法檢測: 提取各組小鼠右肺肌組織總蛋白，隨后對其進行SDS-PAGE電泳。電泳結束后，將凝膠中的蛋白進行轉膜，隨后分別用抗collagen Ⅰ、α-SMA、NRF2及GAPDH的一抗在4℃下孵育過夜。次日，于二抗(羊抗兔)稀釋液中避光孵育50min。孵育結束后，使用Odyssey掃膜儀對各蛋白條帶掃描并定量，以GAPDH作為內參蛋白對各樣本目的蛋白進行校正。

結 果

1.各組小鼠肺組織HE染色及Masson染色結果： 在BLM注射后的28天，取肺組織進行Masson染色及HE染色。結果表明，BLM刺激可明顯促進小鼠肺組織膠原沉積和病理損傷，增加小鼠Ashcroft評分(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干預均可明顯減輕小鼠肺組織膠原沉積及病理損傷，降低Ashcroft評分(P<0.05)，詳見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織HE染色及Masson染色結果(×200)與對照組比較, *P<0.05；與模型組比較, #P<0.05

2.各組小鼠肺組織氧化應激和羥脯氨酸水平的比較：接下來，BLM注射28天后，BLM刺激可明顯增加小鼠肺組織MDA水平(P<0.05)，同時抑制超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干預后，肺纖維化小鼠肺組織中MDA水平明顯降低(P<0.05)，SOD活性明顯增加(P<0.05)。模型組小鼠肺組織中羥脯氨酸水平較對照組明顯增加(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kg ZO干預后，肺纖維化小鼠肺組織中羥脯氨酸水平均明顯降低(P<0.05)，詳見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織氧化應激和羥脯氨酸水平的比較與對照組比較, *P<0.05；與模型組比較, #P<0.05

3.各組小鼠肺組織纖維化標志蛋白的表達狀況：Western blot法檢測結果表明，模型組小鼠肺組織中collagenⅠ和α-SMA表達水平較對照組明顯增加(P<0.05)；10mg/kg和20mg/kgZO干預后，肺纖維化小鼠肺組織中上述兩種蛋白水平均明顯降低(P<0.05)，詳見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織纖維化標志蛋白的表達狀況與對照組比較, *P<0.05；與模型組比較, #P<0.05

4.各組小鼠肺組織NRF2的蛋白表達狀況：Western blot法檢測結果表明，模型組小鼠肺組織中NRF2表達水平較對照組明顯降低(P<0.05)。10mg/kg和20mg/kgZO干預后，肺纖維化小鼠肺組織中NRF2表達水均明顯升高(P<0.05)，詳見圖4。

圖4 各組小鼠肺組織NRF2的蛋白表達狀況與對照組比較, *P<0.05；與模型組比較, #P<0.05

討 論

肺纖維化是各種慢性肺部疾病共有的病理改變[9]。機體為修復肺間質的慢性損傷，間質細胞會持續分泌膠原蛋白，最終導致肺內細胞外基質沉積及肺組織結構破壞[10]。正常肺組織由肺上皮細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞及巨噬細胞組成。這些細胞在病理因素，如BLM、高糖或長期空氣污染的刺激下可通過不同機制導致肺纖維化的發生[11]。例如，成肺纖維細胞可通過增殖分化為肌成纖維細胞，產生大量膠原沉積于細胞外基質； 2型上皮細胞不僅可以通過細胞凋亡的方式導致肺上皮再生受損及肺骨架缺失，還可通過上皮-間質轉化的方式增加間質細胞的數量，最終導致肺纖維化進展[12]。此外，內皮細胞則可通過內皮-間質轉化的方式加重肺纖維化[13]。巨噬細胞在病理刺激下，可由M1轉化為M2型，產生促纖維化因子包括轉化生長因子(transforming growth factor-β，TGF-β)和血小板源性生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)，導致肺纖維化[14]。因此，以上述細胞為靶點進行干預，是肺纖維化防治的重要策略。

在肺纖維化的進展過程中，氧化應激被明顯激活。例如，大量ROS可導致肺上皮細胞DNA損傷和凋亡，通過誘發TGF-β的激活和釋放；此外ROS還可促進成纖維細胞向肌成纖維細胞的轉分化[15，16]。研究顯示，NRF2在多種疾病模型中可顯著抑制細胞內ROS生成，同時，NRF2還可轉錄激活多種抗氧化基因，發揮細胞保護作用。NRF2基因敲除小鼠相較于野生型小鼠在BLM刺激下更易產生肺纖維化表型[17]。體外實驗也表明，NRF2 抑制不僅增加了成纖維細胞氧化應激水平，還誘導了其向肌成纖維細胞的表型轉化[18，19]。這些實驗結果表明，NRF2是干預肺纖維化的重要靶點。

ZO作為一種生姜中提取的天然化合物，具有重要的抗纖維化作用，包括心肌纖維化和肝臟纖維化。在心肌纖維化中，ZO可通過激活eNOS/NRF2軸抑制氧化應激進而減輕心肌組織中膠原纖維合成，發揮心臟保護作用[8]。在非酒精性脂肪肝中，ZO可通過改善小鼠血糖、血脂、肝功能進而減輕肝臟纖維化[20]。本研究中筆者發現，兩種劑量的ZO干預不僅可明顯減輕小鼠肺組織病理損傷和肺間質膠原沉積，還可抑制小鼠肺組織纖維化。機制上，ZO可明顯上調IPF小鼠肺組織中NRF2的表達。

綜上所述，ZO可能通過激活NRF2改善BLM誘導小鼠肺纖維化和氧化應激，發揮肺保護作用。