EB1在小鼠神經系統中表達和功能

宋彬彬 甄 然 彭 宇 丁思妍 楊 璇 于 佳

微管是真核細胞中重要的骨架結構和胞內運輸軌道，其散布于胞質中，對于維持細胞結構、形態和功能具有重要作用[1]。微管正端示蹤蛋白可特異定位于微管正端，具有保守的特定序列和復雜的相互作用網絡，參與調控微管的動態變化，影響細胞內微管依賴的各種生物學過程。微管末端結合蛋白1(end-binding protein 1，EB1)可自發的定位于微管正端，呈彗星狀分布，能招募含特定序列的多種蛋白在微管正端的聚集，是形成微管正端示蹤蛋白網絡的中心分子[2,3]。近年來有報道顯示口腔鱗狀細胞癌患者中EB1過表達[4]。佩里綜合征患者致病基因DCTN1的突變位點位于其與EB1相互作用結構域[5]。以上提示EB1含量和功能異常與多種疾病發生相關。本研究通過生化方法以1.5月齡野生型小鼠、成纖維細胞和HEK293細胞為材料，檢測EB1在小鼠神經系統和細胞中表達和分布，以及EB1在細胞自噬通路中的作用。

材料與方法

1.主要儀器和試劑：siRNA轉染試劑購自德國QIAGEN公司；10% SDS溶液、蛋白酶抑制劑、蛋白定量試劑盒、蛋白電泳預制膠、超聲波細胞破碎儀、熒光標記二抗以及封片液購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Turbo轉印包、Trans-Blot Turbo轉印系統購自美國Bio-Rad公司；雞抗神經絲重鏈(neurofilament heavy chian，NFH)單克隆抗體、山羊抗p150glued多克隆抗體購自英國Abcam公司；鼠抗EB1單克隆抗體購自美國BD公司；兔抗EB1多克隆抗體、鼠抗β-actin單克隆抗體、兔抗GAPDH多克隆抗體購自美國Sigma-Aldrich公司；豚鼠抗p62多克隆抗體購自日本MBL Life Science公司；兔抗LC3B多克隆抗體購自美國Novus Biologicals公司；熒光標記二抗、Odyssey紅外激光成像系統購自美國LI-COR公司。

2.實驗動物：野生型C57BL/6J小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，根據實驗動物相關規定進行管理和操作。迅速取材小鼠眼(eye)、嗅球(olfactory bulb,OB)、皮質(cortex,CX)、海馬(hippocampus,HC)、紋狀體(striatum,Str)、中腦(midbrain,Mid)、小腦(cerebellum,CB)、腦干(brainstem,BS)、脊髓(spinal cord,SC)、坐骨神經(sciatic nerve,SN)和腓腸肌(gastrocnemius muscle)，凍存于-80℃冰箱。

3.細胞培養與傳代：小鼠原代成纖維細胞培養于含有10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，培養于含5% CO2的37℃恒溫培養箱。HEK293細胞培養于含有10%胎牛血清和100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中，培養于含5% CO2的37℃恒溫培養箱中。顯微鏡下觀察細胞生長至80%～90%時用1×TrypLETMExpress Enzyme消化、傳代，待細胞增殖旺盛、狀態良好時進行實驗。

4.siRNA轉染:細胞消化后，按照每孔5×105個細胞傳代到6孔板中，按照QIAGEN公司HiPerFect Transfection Reagent轉染試劑說明書進行EB1 siRNA和scrambled siRNA轉染。

5.蛋白免疫印跡法檢測蛋白表達水平:1% SDS裂解液裂解HEK293細胞或小鼠組織樣品，超聲破碎(25% amplitude, 10s on,10s off,3個循環)，室溫離心16800×g，10min，收集上清為總蛋白提取液。采用BCA試劑盒測定蛋白濃度，取各組等量蛋白提取液經10% SDS-PAGE和NuPAGE預制凝膠電泳，再將預制凝膠中蛋白質電轉至硝酸纖維素(nitrocellulose,NC)膜上。將NC膜放入封閉液中封閉30min，加入一抗兔抗EB1、豚鼠抗p62、兔抗LC3B、鼠抗β-actin、兔抗GAPDH、雞抗NFH，4℃孵育過夜。PBST漂洗5min×3次，將NC膜放入熒光素IRDye?標記的山羊抗兔或山羊抗雞或山羊抗鼠或山羊抗豚鼠二抗中，孵育1h，PBST漂洗5min×3次，采用Odyssey凝膠成像儀檢測蛋白質顯色，Image J軟件定量蛋白條帶的相對灰度。

6.免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡技術：小鼠原代成纖維細胞接種于鋪有玻片的24孔板中，貼壁后用-20℃預冷甲醇固定10min后，PBS緩沖液洗5min×3次。封閉液室溫封閉30min后，使用一抗鼠抗EB1、山羊抗p150glued室溫孵育2h，PBS緩沖液洗5min×3次，使用Alexa Fluor 488/546/647標記的二抗進行免疫染色，室溫孵育1h，PBS緩沖液洗5min×3次，封片晾干。使用Zeiss共聚焦激光掃描顯微鏡(LSM880)拍照，使用Image J軟件進行圖像分析。

結 果

1.微管正端示蹤蛋白EB1在小鼠成纖維細胞中位于微管正端：免疫熒光和激光共聚焦顯微鏡技術檢測結果顯示，小鼠成纖維細胞中EB1(綠色熒光)主要聚集于p150glued蛋白標記的微管(紫色熒光)的正端，且呈彗星狀分布(圖1)。

圖1 成纖維細胞中EB1蛋白表達與分布成纖維細胞中EB1(綠色熒光)、p150glued(紫色熒光)和DAPI(藍色熒光)三重免疫熒光染色

2.微管正端示蹤蛋白EB1在小鼠神經系統中表達和分布：蛋白印跡法檢測結果顯示，微管正端示蹤蛋白EB1在小鼠眼、嗅球、皮質、海馬、紋狀體、中腦、小腦、腦干、脊髓、坐骨神經和肌肉中都有一定表達，但其含量具有組織部位差異性(圖2中A、B)。β-actin為非肌肉型actin，在肌肉組織中不表達。與脊髓比較，小鼠坐骨神經中EB1蛋白含量均顯著下降(圖2中C、D)。

圖2 小鼠組織中EB1蛋白表達和分布A.EB1在小鼠眼、腦、脊髓、坐骨神經和腓腸肌中蛋白表達水平；B. EB1在小鼠眼、腦、脊髓、坐骨神經和腓腸肌中蛋白表達水平的定量分析；C.EB1在小鼠脊髓和坐骨神經中蛋白含量；D. EB1在小鼠脊髓和坐骨神經中蛋白含量的定量分析

3.EB1 siRNA在HEK293細胞的自噬溶酶體通路中作用：蛋白印跡法檢測結果顯示，HEK293細胞中轉染EB1 siRNA可顯著下調EB1蛋白水平(P<0.01)。且HEK293細胞中敲減EB1可引起自噬通路中關鍵分子p62和LC3B-Ⅱ蛋白含量顯著上調(P<0.05)，而LC3B-Ⅰ蛋白水平未發生明顯變化(P>0.05，圖3)。

圖3 HEK293細胞中敲減EB1對自噬通路關鍵蛋白含量影響A.HEK293細胞中EB1含量下降引起自噬通路關鍵蛋白含量變化；B. HEK293細胞中EB1含量下降引起自噬通路關鍵蛋白含量變化的定量分析。ctrl.hek293細胞中轉染scramble siRNA;siRNA.hek293細胞中轉染EB1 siRNA

討 論

微管是真核細胞中廣泛存在的纖維管狀結構，其兩端具有極性，負端位于近核區，聚合速度慢，較穩定；正端指向胞質，處于動態的聚合解聚的快速轉換狀態，即動態不穩定性(dynamic instability)[6]。微管正端示蹤蛋白EB1通過其N端的CH結構域(calponin homology domain, CHD)直接與微管蛋白結合，特異性聚集于微管正端。C端具有卷曲螺旋結構域負責介導EB1二聚體的形成，且C端也可介導其與具有CAP-Gly和SxIP等特定修飾的微管正端示蹤蛋白相互作用[7,8]。本研究檢測了體外培養的野生型小鼠成纖維細胞中EB1的定位和分布，確認了EB1隨微管分散于胞質，且在微管正端高度聚集，呈彗星狀分布。

EB1廣泛表達于機體各組織部位，參與調控微管動力學和穩定性[9]。研究發現，EB1定位于生長的微管末端，可促進微管持續增長[10]。EB1功能缺失時彗星狀結構縮短，生長的微管末端數量減少且生長速率下降，提示微管可能處于崩解狀態[11]。HeLa細胞中EBs功能缺失使Clip170和Clasp1在微管正端聚集減少，微管生長和縮短速率均顯著下降，崩解和重建頻率均顯著提高。微管負端在高爾基體聚集減少，而隨機分布于胞質中[12]。破骨細胞中微管調控足體的形成，過表達EB1可促進破骨細胞成熟，而EB1功能缺失可通過破壞微管動態不穩定性而抑制足體形成帶狀結構[13]。本研究結果進一步證實，EB1在小鼠眼、嗅球、皮質、海馬、紋狀體、中腦、小腦、腦干、脊髓、坐骨神經以及肌肉中均有表達，且表達水平具有組織部位差異性。與脊髓比較，坐骨神經中EB1蛋白含量均顯著下降(P<0.05)，這提示神經元亞細胞結構軸突束(坐骨神經)中EB1水平較低于胞體(脊髓)。而EB1對于微管具有重要調節作用，因此軸突束中EB1蛋白含量或功能的細微變化即有可能對神經元產生重要影響。

自噬是一種重要的胞內穩態調控機制，是自噬小體包裹待降解貨物后通過溶酶體實現降解功能的細胞代謝過程。LC3B是廣泛用于檢測自噬小體形成、成熟和自噬活性的重要標志蛋白[14]。p62可選擇性募集泛素化蛋白質，并與LC3結合，參與自噬小體的形成[15]。研究發現，微管及微管相關蛋白可調控自噬小體的形成、運輸及其與溶酶體的融合過程[16]。Huh-7細胞中藥物破壞微管可明顯促進自噬小體的生成[17]。Wei等[18]研究發現，EB1可與CAMSAP2蛋白相互作用，調節非中心體微管的動力學特性。破壞EB1與CAMSAP2的結合可影響EB1在微管末端分布，改變微管生長方向，使自噬小體逆向運輸障礙，導致LC3-Ⅱ蛋白水平提高，自噬小體積累。本研究發現，HEK293細胞中敲減EB1可引起p62和LC3A/B-Ⅱ蛋白含量顯著上調(P<0.05)，這提示EB1缺失可能通過引起微管正端結構和功能障礙而引起自噬小體積累，導致自噬異常。

綜上所述，微管正端示蹤蛋白EB1可招募蛋白質在微管正端的定位，是連接微管正端示蹤蛋白網絡的關鍵分子，對于調控微管穩定性和動力學具有重要作用[19]。本研究檢測了EB1在小鼠經系統中的表達，發現其廣泛存在且具有組織部位特異性。與胞體比較，軸突束中EB1蛋白含量顯著下降。EB1特異性聚集于微管正端，在HEK293細胞中敲減EB1可能通過破壞微管正端結構和功能，減少自噬小體的形成和運輸，從而引起自噬異常。自噬異常與神經元損傷和死亡密切相關[20]。本研究可為揭示微管正端示蹤蛋白EB1如何參與神經系統疾病提供科學依據。