胃癌中PDLIM5的表達及臨床意義

張邢松，沈 蓉，繆小兵

胃癌是一種多分子和組織學亞型的異質性疾病[1]。2014年，癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas, TCGA)將胃癌分為EBV陽性型、微衛星不穩定型(microsatellite instability, MSI)、基因組穩定型以及染色體不穩定型4種亞型[2]。骨架蛋白PDLIM5(PDZ and LIM domain 5) 也稱ENH，是PDZ-LIM結構域蛋白家族成員，最初被鑒定為PKC激酶結合蛋白。除PKC外，PDLIM5還可以結合多種蛋白激酶，包括PKD、AMPK以及PKA。PDLIM5包含1個PDZ以及3個介導蛋白質間相互作用的LIM結構域[3]。作為肌動蛋白銜接蛋白，PDLIM5不僅參與細胞骨架形成和器官的發育，還在多種腫瘤的發生、發展中發揮作用。據報道，PDLIM5在多種腫瘤中表達上調，如非小細胞肺癌、甲狀腺乳頭狀癌、前列腺癌[3-5]。PDLIM5在胃癌中表達的研究甚少。本實驗采用免疫組化法并結合在線數據庫，分析PDLIM5在胃癌中表達的作用及臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料收集2013年～2015年江蘇省南通市腫瘤醫院病理科確診的胃癌患者212例。所有患者術前均未行放、化療或靶向治療?；颊吣挲g27～82歲，中位年齡66歲。男性165例，女性47例。按Lauren分型：腸型99例、彌漫型78例、混合型35例。按pT分期：pT1 29例、pT2 24例、pT3 71例、pT4 88例。按pN分期：pN0 64例、pN1/N2/N3 148例。無脈管侵犯134例，有脈管侵犯78例。無神經侵犯124例，有神經侵犯88例。pTNM分期：Ⅰ期35例、Ⅱ期60例、Ⅲ期117例。腫瘤直徑≤4 cm 110例、>4 cm 102例。錯配修復缺陷型(deficient mismatch repair, dMMR)43例、錯配修復正常型(proficient mismatch repair, pMMR)169例。EBV編碼的小RNA(Epstein-Barr virus-encoded small RNA, EBER)陽性7例，陰性205例。

1.2 方法

1.2.1免疫組化 PDLIM5一抗(稀釋度1 ∶200)購自Abcam公司；一抗MLH1(克隆號ES05，稀釋度1 ∶100)、MSH2(克隆號RED2，稀釋度1 ∶100)、MSH6(克隆號EP49，稀釋度1 ∶600)以及PMS2(克隆號EP51，稀釋度1 ∶100)均購自北京中杉金橋公司，二抗及DAB試劑購自丹麥Dako公司。免疫組化染色采用EnVision法，染色步驟按試劑盒說明書進行。以PBS代替一抗作為陰性對照，已知陽性切片作為陽性對照。

1.2.2原位雜交(in situ hybridization, ISH) 按北京中杉金橋公司EBER原位雜交試劑盒(ISH-5021)說明書進行。以EBER陽性的鼻咽癌組織作為陽性對照，以雜交液作為陰性對照。EBER陽性信號定位于細胞核，呈棕黃色。

1.3 免疫組化結果判讀PDLIM5評分采用H-score法。參考Chen等[6]的標準，按著色強度評分：無著色為0分，黃色為1分，棕黃色為2分，棕色為3分。H-score=3×棕色細胞百分數+2×棕黃色細胞百分數+1×黃色細胞百分數。H-score范圍0～300。以中間值為截點，將H-score<150定義為PDLIM5低表達，將H-score≥150定義為PDLIM5高表達。MLH1、MSH2、MSH6以及PMS2四種錯配修復蛋白均定位于細胞核，核呈黃色、棕黃色或棕色判定為陽性，陽性細胞數<10%判定為表達缺失。

1.4 Kaplan-Meier Plotter數據分析在Kaplan-Meier Plotter數據分析平臺中檢索PDLIM5基因，應用在線分析軟件繪制生存曲線。

1.5 統計學分析采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。應用Pearson χ2或Fisher精確概率檢驗分析PDLIM5表達與胃癌臨床病理特征的關系。采用Kaplan-Meier法繪制患者生存曲線，生存曲線的比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PDLIM5表達與胃癌臨床病理特征的關系PDLIM5表達定位于細胞膜/質。212例胃癌中，PDLIM5高表達173例，低表達39例。PDLIM5在胃癌組織(H-socre 196.3±4.886)中的表達顯著高于癌旁胃黏膜組織(H-socre 148.7±4.628)(P<0.000 1，圖1)。PDLIM5表達與患者性別、年齡、Lauren分型、pT分期、脈管侵犯、神經侵犯、淋巴結轉移、pTNM分期、腫瘤直徑及EBER表達無關(P均>0.05)；PDLIM5表達與錯配修復蛋白(MLH1、MSH2、MSH6及PMS2)的表達相關：其在pMMR患者中的表達高于dMMR患者(P=0.007，表1，圖2、3)。

圖1 A.PDLIM5在胃癌組織中高表達；B.PDLIM5在對應癌旁胃黏膜組織中低表達，EnVision法 圖2 A.錯配修復正常型胃癌中MLH1陽性；B.錯配修復正常型胃癌中MSH2陽性；C.錯配修復正常型胃癌中MSH6陽性；D.錯配修復正常型胃癌中PMS2陽性，EnVision法 圖3 錯配修復正常型胃癌中PDLIM5高表達，EnVision法

表1 胃癌中PDLIM5表達與臨床病理特征的關系

2.2 PDLIM5表達與胃癌患者預后的關系本組對Kaplan-Meier Plotter數據庫中PDLIM5 mRNA的表達進行挖掘，發現了9個相關基因芯片數據，分別為Affymetrix ID：203242_s_at、203243_s_at、211680_at、211681_s_at、212412_at、213684_s_at、216803_at、216804_s_at、221994_at，其中7個基因芯片數據(203242_s_at、211680_at、211681_s_at、213684_s_at、216803_at、216804_s_at、221994_at)顯示：PDLIM5 mRNA高表達患者較低表達患者的總生存期(overall survival, OS)明顯縮短(P均<0.05)。對212例胃癌患者進行生存分析發現，PDLIM5蛋白表達與患者OS無明顯相關性(P=0.761，圖4)。

圖4 Kaplan-Meier生存曲線分析PDLIM5蛋白表達與患者預后的關系

3 討論

PDLIM5是由Kuroda等[7]于1996年以蛋白激酶C為誘餌蛋白通過酵母雙雜交技術首次鑒定發現。PDLIM5基因位于人染色體4q22.3，由一個N端的PDZ結構域和3個C端的LIM結構域組成，編碼相對分子質量為6.3×104的細胞質蛋白。PDLIM5可通過其PDZ結構域與細胞骨架和膜蛋白結合，并通過其LIM結構域與各種信號分子(包括蛋白激酶和轉錄因子)相互作用。PDLIM5在調節細胞增殖、分化和細胞命運中起重要作用。在中樞神經元中，PDLIM5主要定位于細胞膜及細胞質，于細胞膜/質中調節神經元鈣信號傳導，并與神經遞質突觸囊泡共定位。有研究發現，PDLIM5表達異常與多種精神障礙有關[8]。PDLIM5在骨骼肌和心肌中高表達[9]。有研究發現，PDLIM5可通過PDZ結構域與α-肌動蛋白結合，從而在心臟發育中起作用[10]。

有研究報道，PDLIM5在非小細胞癌[3]及前列腺癌[5]組織中的表達高于癌旁組織。與上述研究相似，本實驗結果證實PDLIM5在胃癌組織(H-socre 196.3±4.886)中的表達顯著高于癌旁胃黏膜組織(H-socre 148.7±4.628)(P<0.000 1)。Liu等[5]研究發現，在前列腺癌中PDLIM5高表達與高Gleason評分、高PSA水平以及轉移相關。本實驗發現，PDLIM5在pMMR患者中的表達高于dMMR患者(P=0.007)；但PDLIM5表達與患者性別、年齡、Lauren分型、pT分期、脈管侵犯、神經侵犯、淋巴結轉移、pTNM分期、腫瘤直徑及EBER表達無關(P均>0.05)。據報道，在非小細胞癌[3]、前列腺癌[5]以及甲狀腺乳頭狀癌[4]中PDLIM5高表達可促進腫瘤細胞的遷移、侵襲。在非小細胞癌中PDLIM5通過增強SMAD3的穩定性促進TGFβ信號傳導；而敲低PDLIM5可抑制TGFβ誘導的上皮-間質轉化[3]。在DU145以及PC-3前列腺癌細胞中，PDLIM5可通過與AMPK直接相互作用抑制AMPK的降解，促進AMPK活化，敲低PDLIM5可通過誘導細胞周期G2/M期停滯和細胞凋亡抑制腫瘤細胞的增殖和克隆形成[5]。Xie等[11]研究發現，敲低lncRNA AGAP2-AS1還可通過調節miR-195-5p依賴PDLIM5的下調繼而抑制前列腺癌的發展。在甲狀腺乳頭狀癌中，PDLIM5通過活化Ras-ERK信號通路促進甲狀腺乳頭狀癌的發展[4]。

Shi等[3]報道，PDLIM5高表達與非小細胞肺癌預后不良相關。Liu等[5]同樣發現，PDLIM5高表達的前列腺癌患者預后不良。本組對Kaplan-Meier Plotter數據庫中PDLIM5的表達進行挖掘，發現其中7個基因芯片數據(203242_s_at、211680_at、211681_s_at、213684_s_at、216803_at、216804_s_at、221994_at)，結果顯示：PDLIM5 mRNA高表達患者較低表達患者的OS明顯縮短(P均<0.05)。PDLIM5蛋白表達水平與患者的OS無相關性(P=0.761)。

綜上所述，本實驗結果顯示，PDLIM5在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁胃黏膜組織，且PDLIM5在pMMR型胃癌患者中的表達高于dMMR型患者。PDLIM5 mRNA高表達患者較低表達患者OS明顯縮短。PDLIM5有望成為胃癌潛在的預后標志物。