SEMA3A、SEMA3B蛋白免疫組化染色中抗原修復方法的優化

閆紅娟，馬曉平，李 曼，張 楠，郁曉丹，徐 江

信號素3A(SEMA3A)是信號蛋白家族成員中第一個被研究的潛在腫瘤抑制因子，其被認為是一個候選的抑癌基因。近期研究表明，SEMA3A在不同類型腫瘤，如黏液表皮樣癌[1]、舌鱗狀細胞癌[2]、頭頸部鱗狀細胞癌[3]、胃癌[4]、前列腺癌[5]等中均呈低表達。SEMA3B是信號蛋白家族成員，具有抑制腫瘤細胞的功能，是一個位于染色體3p21.3區域的抑癌基因。SEMA3B在黏液表皮樣癌[1]、食管鱗狀細胞癌[6]、胃癌[7]等多種惡性腫瘤中均呈不同程度的表達缺失和下調。故采用免疫組化法檢測SEMA3A和SEMA3B蛋白的表達具有重要意義。抗原修復技術是影響免疫組化染色的重要因素[8]，不同抗原修復法會直接影響SEMA3A和SEMA3B的免疫組化染色質量。選擇合適的抗原修復方法是免疫組化成功與否的關鍵，尤其是關于抗原修復方法和修復液的選擇，目前，高壓修復和微波修復是兩種最常見的熱修復方法，枸櫞酸緩沖液和EDTA緩沖液是最兩種常使用的修復液。免疫組化染色顯示SEMA3A和SEMA3B表達主要定位于細胞質。為了更好的展示細胞質抗原免疫組化染色效果，本實驗選擇了不同的熱修復方法和修復液，對上述細胞質蛋白進行免疫組化檢測，尋找最佳的修復方法，以提高細胞質抗原染色的準確性和可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑收集2015～2020年石河子大學醫學院第一附屬醫院手術切除的口腔鱗狀細胞癌癌旁正常組織標本40例，所有病例病理診斷明確。Olympus BX51圖像分析儀；2.5 L高壓鍋；美的家用微波爐；SEMA3A抗體(1 ∶200，Abcam公司，Cambridge，UK)、SEMA3B抗體(1 ∶500，Abcam公司，Cambridge，UK)；EnVision檢測試劑盒(Dako公司)；DAB顯色試劑盒(Dako公司)；枸櫞酸緩沖液(pH 6.0)和EDTA緩沖液(pH 9.0)為本實驗室所配制。

1.2 方法將蠟塊組織連續切片，切片插入切片架內置于65 ℃的電熱恒溫干燥箱中烘烤2 h以上，防止掉片。按照免疫組化EnVision法染色步驟操作。將脫臘至水的切片在同一實驗條件下、同一時間內進行抗原修復，根據抗原修復條件不同，分為高壓-EDTA緩沖液修復組、高壓-枸櫞酸緩沖液修復組、微波-EDTA緩沖液修復組、微波-枸櫞酸緩沖液修復組。

抗原修復：使用熱修復方法，修復液使用EDTA緩沖液或枸櫞酸緩沖液。高壓修復：將修復盒內的EDTA緩沖液(或枸櫞酸緩沖液)及高壓鍋中的水分別加熱至沸騰，隨后將切片依次插入修復盒內的切片架上，修復盒放入高壓鍋的置物架上，高壓鍋加蓋，電磁爐1 800 W加熱至噴氣，調至800 W計時8 min后關閉電源，放氣并取出修復盒，修復盒置于室溫下自然冷卻至30 ℃～40 ℃；微波修復：將修復盒內的EDTA緩沖液(或枸櫞酸緩沖液)置于微波爐中高火煮至沸騰，將切片依次插入修復盒內的切片架內，修復盒放入微波爐中低火加熱30 min，取出修復盒，修復盒置于室溫下自然冷卻至30 ℃～40 ℃。

切片浸入新鮮配制的3%雙氧水中，室溫下孵育10 min，蒸餾水沖洗3次，PBS震洗3次，每次5 min，各組切片分別滴加100 μL最佳工作濃度的一抗，濕盒置于4 ℃冰箱中孵育過夜，室溫下復溫，PBS震洗，每張切片上滴加100 μL二抗后，37 ℃恒溫箱中孵育30 min，PBS震洗，DAB顯色，蘇木精復染，自來水藍化，透明，封固。PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

1.3 結果判定SEMA3A、SEMA3B主要定位于細胞質，呈黃色或棕黃色為陽性。SEMA3A、SEMA3B染色參照標準[1]：光鏡下觀察陽性細胞百分比和染色強度。(1)按陽性細胞占所觀察細胞的百分比計分：陽性細胞百分比≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，>50%為3分。(2)按陽性細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。每個標本最終的陽性或陰性結果由兩種計分方法的乘積來判定：≤3為陰性，>3為陽性。

2 結果

2.1 不同抗原修復方法對口腔鱗狀細胞癌癌旁正常組織中SEMA3A染色的影響SEMA3A蛋白以口腔鱗狀細胞癌癌旁正常組織細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。使用不同抗原修復方法及修復液修復后，高壓修復的免疫組化染色陽性強度高于微波修復法。高壓-EDTA緩沖液修復組陽性強度最強，細胞質明顯著色，定位準確，表達效果最理想(圖1A)。高壓-枸櫞酸緩沖液修復組、微波-EDTA緩沖液修復組陽性強度下降(圖1B、C)。微波-枸櫞酸緩沖液修復組陽性強度最弱，效果不理想(圖1D)。

圖1 SEMA3A抗體：A.高壓-EDTA緩沖液修復組；B.高壓-枸櫞酸緩沖液修復組；C.微波-EDTA緩沖液修復組；D.微波-枸櫞酸緩沖液修復組 圖2 SEMA3B抗體：A.高壓-EDTA緩沖液修復組；B.高壓-枸櫞酸緩沖液修復組；C.微波-EDTA緩沖液修復組；D.微波-枸櫞酸緩沖液修復組

2.2 不同抗原修復方法對口腔鱗狀細胞癌癌旁正常組織中SEMA3B染色的影響SEMA3B蛋白以口腔鱗狀細胞癌癌旁正常組織細胞質出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性細胞。使用不同抗原修復方法及修復液修復后，高壓-EDTA緩沖液修復組染色均勻，背景清晰，對比明顯，染色效果最理想(圖2A)。高壓-枸櫞酸緩沖液修復組陽性強度提高，但出現背景著色，染色效果欠佳(圖2B)；微波-EDTA緩沖液修復組陽性強度明顯提高，但普遍出現背景著色且背景染色深(圖2C)。微波-枸櫞酸緩沖液修復組背景染色深，出現假陽性，效果不理想(圖2D)。

3 討論

免疫組化技術是對組織切片或細胞標本中的某些化學成分進行原位定性、定位或半定量研究[9]。石蠟包埋組織經甲醛固定，組織中蛋白質的氨基與固定液中的醛基交聯，導致部分蛋白抗原簇被封閉，從而在一定程度上影響組織染色效果[10]。通過抗原修復可以使抗原決定簇重新暴露并與抗體有效結合，因此抗原修復是影響組織染色效果的最關鍵因素。不同修復方式均有各自的優點和局限性，應當依據抗原特性選擇合適的修復方法，以取得最佳修復效果。本實驗選用不同的抗原修復方式和抗原修復液，檢測SEMA3A和SEMA3B蛋白的表達，其中SEMA3A蛋白經高壓修復的免疫組化染色陽性強度高于微波修復。高壓-EDTA緩沖液修復組陽性強度最強，細胞質明顯著色，定位準確，表達效果最理想。SEMA3B蛋白經高壓-EDTA緩沖液修復組染色均勻，背景清晰，對比明顯，表達效果最理想。因此，用高壓-EDTA緩沖液作為SEMA3A和SEMA3B抗原修復方法能夠取得較理想的染色效果，值得推廣。

臨床上關于抗原修復方式的報道較多，常見的有微波、高壓、電爐加熱、酶消化等[11]。高壓和微波修復法是目前應用最廣泛的組織抗原修復法，效果較為肯定[9,12]。高溫高壓熱修復法是最有效、最穩定的抗原修復方法[13-14]。本實驗通過對組織進行高壓及微波處理的對照實驗中發現，高溫高壓抗原修復法的修復效果明顯優于微波抗原修復法；與李紹剛等[15]和袁士成等[16]的研究結果一致。由于微波熱修復過程中的微波焦點范圍小，組織切片接收到的微波輻射量少且不均勻，并且不同區域的組織處理強度不一致，導致不同區域染色深淺不同，邊緣效應比較明顯。高壓熱修復法熱效率高且均勻；暴露抗原決定簇效果優于微波修復，這使得弱陽性、假陰性的組織獲得更可靠、更準確地表達，組織陽性定位準確，染色均勻，特異性強，結果穩定，背景著色較弱，可以提高抗原抗體陽性檢測率，操作簡便，節省時間，陽性率較微波抗原修復法高。但高壓法的缺點是容易脫片或使組織出現大小不等的缺損。

目前，常用的抗原修復液有EDTA修復液和枸櫞酸修復液。本實驗中分別采用枸櫞酸緩沖液和EDTA緩沖液處理組織切片。結果表明，高pH值的EDTA緩沖液修復的切片免疫化學染色效果明顯優于枸櫞酸緩沖液。這或許是因為EDTA緩沖液是一種螯合劑，能夠消除由福爾馬林固定引起的不利因素。崔錦珠[17]和廖德貴等[18]分別報道高pH值的EDTA緩沖液的效果優于檸檬酸鹽緩沖液。Shi等[19]報道了在不同pH值下抗原修復對免疫組化染色結果的影響，他們認為在高pH值下的高溫高壓抗原修復對于大部分的胞質抗體均能取得良好的效果。因此，高pH值下的高壓修復法，具有操作時間短、抗原修復好且結果穩定等優點，目前普遍應用于大多數細胞質抗原的修復中[20]。高溫高壓EDTA緩沖液抗原修復法可使多數胞質抗體達到理想的染色結果，是一種值得推廣使用的免疫組化抗原修復法。

本實驗僅在口腔鱗狀細胞癌癌旁正常石蠟組織標本中，對SEMA3A和SEMA3B細胞質蛋白通過不同的抗原修復方式及修復液，進行修復實驗且比較免疫組化染色結果，而對于其他細胞質蛋白是否也存在與本實驗相同的結論，尚有待進一步驗證。