過表達FAK對人舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞增殖及侵襲的影響

陳 凱，李張維，廖曉穎，康成容，龔 攀

舌鱗狀細胞癌是口腔頜面及頭頸部位最常見及發病率最高的一種實體惡性腫瘤[1-2]，其具有較強的局部浸潤、侵襲及頸部淋巴結轉移等生物學特征。目前，現有的治療療效均較差[3]，患者5年生存率僅為50%～60%[4-5]。

黏著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)作為非受體型的酪氨酸激酶的一種類型，在正常生理狀態下發揮調節細胞之間、細胞與胞外基質之間黏附作用；與整合素蛋白構成復合體后，又可在細胞生理活動的調控方面發揮作用。已有研究和實驗揭示，FAK表達變化與人惡性腫瘤細胞的生長及轉移關系密切。但以往文獻報道大多局限于臨床病理相關性的研究，尚缺乏在細胞水平對其具體功能和機制的研究。本組前期實驗結果證實，下調舌鱗狀細胞癌細胞中FAK的表達量，可有效影響腫瘤細胞的多項功能[6-7]。為更深入地揭示FAK在舌鱗狀細胞癌細胞生長、轉移過程中的作用，本實驗構建了FAK基因過表達載體，培養高表達FAK的舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞株，探討FAK高表達對舌鱗狀細胞癌細胞增殖、侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料舌鱗狀細胞癌細胞株CAL-27由中山大學附屬第二醫院李勁松教授惠贈。DNA聚合酶試劑盒、Kpn I和BamH I限制性內切酶、DNA連接酶試劑盒、Lipofectamine 2000購自Themro Seientific公司；噻唑藍(MTT)購自Sigma公司；凝膠純化試劑盒購自Qiagen公司；GoScript Reverse Transcription System購自Promega公司；GoTaq qPCR Master Mix試劑盒購自Promega公司；Trizol試劑盒購自TIANGEN公司；FAK單克隆抗體(兔抗)購自英國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1舌鱗狀細胞癌細胞的培養 篩選低轉移CAL-27細胞株，在10%胎牛血清的培養基中接種培養挑選的舌鱗狀細胞癌細胞至對數生長期(培養箱環境設定為37 ℃ 5%CO2)，行下一步實驗。

1.2.2目的基因過表達載體的構建 通過對FAK基因序列及載體pcDNA3.1(+)序列分析，將目的片段克隆到載體中。設計并合成FAK基因的上、下游引物，引物序列如下：FAK-Kpn I-F: 5′-GGGG TACCATGGCAGCTGCTTACCTTGAC-3′(下劃線為Kpn I酶切位點)，FAK-BamH I-R: 5′-CGGGATC CTCAGTGTGGTCTCGTCTGCC-3′(下劃線為BamH I酶切位點)。使用Trizol試劑盒獲取總RNA，經過逆轉錄反應提取cDNA，PCR擴增FAK序列，經過電泳、純化、回收，Kpn I及BamH I雙酶切后，回收目標序列，將目標序列連接到載體pcDNA3.1(+)中。在Trans-T1感受態細胞中加入重構的載體質粒，對菌落進行擴大培養。挑選陽性單克隆，送測序公司(廣州賽哲生物公司)進行測序鑒定。

1.2.3分組和轉染 按照轉染試劑盒說明書，分別將pcDNA3.1(+)-FAK重組載體及pcDNA3.1(+)-NC空載體轉染CAL-27細胞，選取狀態最佳的細胞進一步擴增培養。實驗組為pcDNA3.1(+)-FAK質粒轉染細胞；陰性對照組為pcDNA3.1(+)-NC空載體轉染細胞；空白對照組為野生型CAL-27細胞。

1.2.4qPCR 使用Trizol試劑，提取細胞總RNA；進行質量評估后使用GoScript Reverse Transcription System試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA；qPCR實驗使用GoTaq qPCR Master Mix試劑盒，PCR儀為西安天隆TL988-IV系統。以GAPDH作為內參，采用比較CT法分析相關數據。FAK引物序列：上游5′-TTGGACGATGTATTGGAGAAGG-3′；下游5′-TTTA ATTGCAACCGCCAAAG-3′。

1.2.5Western blot法 在樣品中加入裂解液，提取細胞總蛋白。調配標準蛋白液和工作液，測量570 nm吸光度值，換算蛋白濃度。配備Master Mix和Biotinylated Ladder。Master Mix與蛋白樣品(稀釋比1 ∶4)混合、震蕩后，將各組樣本和Biotinylated Ladder放入沸水5～10 min。按照Wes Separation Module試劑盒說明書要求，去除上樣板封口，對樣品及相關試劑進行上樣操作，在此過程中需注意避免產生氣泡。使用Proteinsimple Wes儀器，運行程序，獲得結果。

1.2.6MTT實驗 將狀態良好的各組舌鱗狀細胞癌細胞在96孔板中接種，設置4個時間點(0、24、48和72 h)，每個時間點為1塊板。待實驗細胞貼壁，更新培養液，加入MTT試劑后繼續培養4 h，再加入DMSO，酶標儀測量吸光度值(492 nm波長處)。

1.2.7Transwell小室實驗 接種實驗細胞前，在Transwell小室上表面涂覆Matrigel溶液，加入無血清培養液，置于培養箱中平衡。對各組實驗細胞進行消化、計數，制成細胞懸液，加入小室上半室；完全培養基加入小室下半室。在小室中培養20 h，棄去下半室培養液，擦除上半室內表面細胞，常溫染色(0.1%無水甲醇結晶紫)。顯微鏡下隨機抽選5個視野拍照，計數，并計算每個視野計數的平均值。

2 結果

2.1 穩定轉染CAL-27細胞后各組中FAK mRNA的表達轉染CAL-27細胞后實驗組中FAK mRNA的相對表達量(11.15±0.23)明顯高于空白對照組(1.00±0.10)和陰性對照組(0.86±0.18)，空白對照組和陰性對照組的表達值僅為實驗組的8.97%和7.71%。實驗組中FAK mRNA的表達顯著上調，與空白、陰性對照組相比，差異有顯著性(F=3 356.83，P<0.01，圖1)。

圖1 各組FAK mRNA的表達

2.2 穩定轉染CAL-27細胞后各組中FAK蛋白表達穩定轉染CAL-27細胞后，Western blot法檢測實驗組中FAK蛋白的相對表達量(0.136 3±0.027 9)明顯高于空白對照組(0.077 7±0.013 6)和陰性對照組(0.814 2±0.010 2)。對照組表達量僅為實驗組的57.0%和59.74%，實驗組中FAK蛋白表達顯著上調，與空白、陰性對照組相比，差異有顯著性(F=8.64，P<0.05，圖2、3)。

圖2 各組中FAK蛋白表達變化

圖3 各組中FAK蛋白表達

2.3 FAK過表達對細胞增殖能力的影響MTT實驗檢測發現，在0 h和24 h時，三組細胞的增殖能力差異無顯著性(F0 h=4.37，P0 h>0.05；F24 h=0.212，P24 h>0.05)。在48 h和72 h時，實驗組的吸光度值均明顯高于空白對照組和陰性對照組，實驗組細胞的增殖活性隨著時間的延長而顯著增強，具有時間依賴性(F48 h=6.41，P48 h<0.05；F72 h=54.40，P72 h<0.01)。FAK基因高表達能增強舌鱗狀細胞癌細胞的增殖能力(圖4)。

圖4 各組細胞的增殖能力變化

2.4 FAK過表達對細胞侵襲能力的影響Transwell小室實驗檢測顯示，實驗組細胞穿膜至下室的數目(98.00±8.80)明顯高于空白對照組(60.20±11.12)及陰性對照組(43.60±7.50)，差異有顯著性(F=45.28，P<0.01)。FAK基因過表達后，舌鱗狀細胞癌細胞的侵襲能力明顯增強(圖5)。

圖5 各組細胞侵襲能力的變化：A.空白對照組；B.陰性對照組；C.實驗組

3 討論

FAK廣泛分布于人體各種細胞內及細胞外基質中，參與多種細胞學行為，在涉及細胞相關信號傳導的過程中發揮極其重要的作用。FAK在受到刺激后，引發黏著斑結構中靶蛋白的磷酸化，介導FAK/PI3K、FAK/Ras/MAPK及FAK/rc/p130CAS/JNK等多種信號傳導通路，是細胞內外信號出入的樞紐。近年，眾多實驗結果亦揭示FAK參與了腫瘤的血管生成，與腫瘤細胞的生長、凋亡及侵襲等生物學行為關系密切[8]。現有研究顯示，泌尿系統腫瘤、消化系統腫瘤、肺癌及子宮頸癌等多種惡性腫瘤的預后不良與FAK的過表達密切相關[9-12]。FAK在舌鱗狀細胞癌中的表達亦顯著增加，且高表達的FAK促進了癌細胞的侵襲和轉移[13]。目前，關于FAK與舌鱗狀細胞癌細胞相互作用的具體機制尚不清楚，相關報道較少，有必要在細胞水平進行深入分析。

在基因學研究中，對目標靶基因的沉默和過表達是最常用的技術和手段。其中，基因過表達技術在研究生物分子間的相互作用及相互關系方面更具優勢；但由于過表達載體不易構建等原因，目前關于人FAK過表達研究方面的報道較少。本實驗成功構建并獲取了過表達FAK的質粒pcDNA3.1(+)，篩選合格的pcDNA3.1(+)-FAK對舌鱗狀細胞癌CAL-27細胞進行轉染，建立了過表達FAK的細胞模型。利用此細胞模型，研究發現FAK高表達可有效提升舌鱗狀細胞癌細胞的增殖活性和侵襲能力。

腫瘤的轉移包含一個復雜的病理、生理過程：癌細胞從腫瘤原發灶剝離后，匯入循環系統，再穿過血管、淋巴管管壁，到達繼發位置，最后在此部位停留、長大，形成腫瘤轉移灶，這其中關聯了多個階段、多條途徑及多種調控機制。在此過程中，腫瘤細胞還必須具備重要的生存特性：(1)抗凋亡特性；(2)在其它組織中生存、增殖的特性。FAK作為多種信號通路中的關鍵調節因子，與腫瘤細胞的增殖和侵襲關系密切，其主要通過以下4條途徑介導細胞的增殖和侵襲：(1)FAK/PI3K-AKT途徑：一般情況下，錨著依賴性生存(anchor-dependent survival)是人體內各種組織細胞均具有的生理特性；一旦組織細胞脫離了相互的黏附、黏著狀態，便易發生死亡，也稱失巢凋亡。而癌細胞則恰恰具備了這種抗凋亡能力：其在脫離黏附后，能夠以一種十分特殊的狀態存活，為腫瘤的遠處轉移創造了可能性。已有研究證實，在口腔惡性腫瘤的轉移過程中，癌細胞的抗失巢凋亡能力發揮了舉足輕重的作用[14]。細胞生存相關的整合蛋白簇聚后，FAK發生磷酸化，刺激PI3K/AKT信號級聯反應，補償了脫黏附腫瘤細胞缺失的生存信號，使其具有脫黏附生存的能力，侵襲和轉移能力也同時得到增強；另外，AKT激活后，促凋亡蛋白BAD和Caspase-9活性受到抑制，進一步增強了腫瘤細胞的抗凋亡能力[15]。(2)MAPK-ERK途徑：FAK通過此信號轉導通路調節多種轉錄因子的活化，模擬細胞生存信號，激活Paxillin蛋白的磷酸化，影響細胞骨架的重組，促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[16]。(3)FAK-p53途徑：p53是目前研究最成熟的一種抑癌因子，能接受多種信號刺激，影響細胞的生長周期，調控細胞老化及凋亡機制的啟動，在抑制細胞的惡性轉化、促進生理性及病理性的DNA損傷修復等方面發揮積極作用[17]。經由非激酶依賴途徑，FAK可與p53、MDM2發生相互反應，誘導并加速p53的泛素化及降解，延緩腫瘤細胞的凋亡；此外，FAK自身攜帶的FERM結構域還可增強p53的活性，加速消除相關激酶類物質，促進腫瘤細胞的增殖[18]。(4)FAK-RIP途徑：NF-κB是重要的促細胞存活的信號效應分子，而受體相互作用蛋白(receptor interacting protein, RIP)可以調節NF-κB的活性，在細胞生存、凋亡及器官發育、免疫應答等信號傳導過程中發揮積極的作用。FAK可以與RIP結合，并激活NF-κB；當FAK高表達時，FAK與RIP的平衡關系受到破壞，誘發細胞增殖處于活躍狀態，細胞凋亡受到抑制。

綜上所述，本實驗結果顯示，FAK過表達可以通過多種復雜的信號通路有效提升舌鱗狀細胞癌細胞的增殖活性和侵襲能力，促進腫瘤的生長。FAK可以為舌鱗狀細胞癌患者的生存期及預后判斷提供參考，對FAK進行更深入的研究不僅有利于揭示舌鱗狀細胞癌的發病機制，也可能為其臨床治療提供新的方向和靶點。