結腸癌中ASPM對細胞增殖、侵襲和凋亡的影響

安曉靜，柏苗苗，謝振年，伍志強，趙 坡

結直腸癌的侵襲和復發是影響預后的主要因素。目前，對于結腸癌的轉移和復發仍缺乏長期有效的治療方法。尋找抑制結腸癌細胞增殖、侵襲和凋亡的靶點對于緩解疾病意義重大。頭小畸形相關基因(abnormal spindle-like microcephaly associated, ASPM)是腫瘤干細胞標志物，在多種實體腫瘤中發揮促癌基因作用[1-2]。在前期研究中發現ASPM在結腸癌組織中表達升高，與結腸癌組織中β-catenin的表達呈正相關[3]。但尚未在體外實驗中探討ASPM對結腸癌細胞生物學性能的影響。本文通過體外實驗觀察ASPM對結腸癌細胞生物學行為的影響及對β-catenin的調節，為結腸癌靶向治療和改善預后積累研究數據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞系 人源結腸癌細胞株SW116、HCT116、HT29、DLD1、SW620和LS180均來自中國人民解放軍總醫學院第一醫學中心生物治療科。

1.1.2試劑 Trizol試劑、反轉錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒購自Gibco公司；DMEM培養基、胎牛血清、Lipofectamine 2000轉染試劑盒購自Invitrogen公司。CCK8試劑盒購自碧云天生物公司；Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡試劑盒購自三箭生物公司；ASPM抗體購自Lifespan公司，β-catenin抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養與轉染 將細胞復蘇后使用含10%FBS的DMEM培養基，在5%CO2、37 ℃細胞培養箱中常規傳代培養，選擇處于生長對數期的細胞作為研究對象。

細胞轉染：選取生長狀態較好的結腸癌細胞進行轉染。首次轉染帶有熒光標記的陰性對照組，熒光顯微鏡下觀察細胞轉染情況，轉染率達80%以上即可。計數細胞密度后接種于6孔板中，按照轉染試劑盒說明書進行操作，siRNA-NC轉染組為陰性對照(negative control, NC)組。將siRNA-ASPM轉染入細胞48 h后，采用qRT-PCR技術檢測細胞中ASPM的表達，選取兩種沉默效果較好的siRNA序列作為后續實驗，設為siRNA1組和siRNA2組。同時設置空白組(未轉染的細胞)。LiCl是Wnt信號通路的激活劑，因此挽救實驗中設置NC組、siRNA組和siRNA+LiCl組。

1.2.2CCK8法檢測細胞增殖 收集轉染成功的細胞，接種于96孔板中，重復3孔，每孔加入培養基200 μL，培養箱內常規培養，取對數生長期的SW116和HCT116細胞，以每孔5×103個細胞接種于96孔板中，常規培養。待細胞生長融合達80%時，加入siRNA，每組設立3個復孔，每孔加入10 μL CCK8溶液，于培養箱中孵育4 h，用酶標儀在450 nm波長處測定每孔的光密度(optical density, OD)值。

1.2.3Transwell實驗檢測細胞侵襲 將小室板上室包被、水化基質膠，于小室板下室中加入550 μL 10%無血清細胞懸液(每毫升細胞5×104個)及siRNA-ASPM，常規培養48 h。取出小室板進行固定染色，中性樹膠封固，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每張載玻片隨機拍攝5個視野，計數并取均值作為1次實驗結果，實驗重復3次。

1.2.4Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率 將細胞平鋪于6孔板中，轉染48 h后，吸出培養液，轉移至離心管中，洗滌細胞。用不含EDTA的胰酶消化細胞，離心，棄去培養液，收集細胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒說明，通過流式細胞儀檢測。

1.2.5Western blot法 siRNA轉染細胞48 h，提取細胞總蛋白。按照每孔50 μg上樣，經SDS-PAGE分離、轉膜、封閉、洗膜，添加ASPM和β-catenin一抗稀釋液，4 ℃孵育過夜，洗膜，加二抗稀釋液，室溫孵育1～2 h，加ECL發光液，在暗盒中使用X光膠片曝光，拍照。Quantity One軟件進行灰度值分析。以目的蛋白與內參蛋白actin的灰度值比值作為各蛋白的相對表達量。實驗重復3次。

1.2.6qRT-PCR 利用Trizol法提取總RNA，紫外分光光度計分析RNA的濃度和純度，逆轉錄獲取cDNA后，采用qRT-PCR擴增目的基因，以actin為內參分析ASPM和β-catenin的表達，反應條件：95 ℃ 2 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，合計40個循環。相對表達量以2-△△Ct表示。

2 結果

2.1 不同結腸癌細胞株中ASPM蛋白表達檢測6種不同結腸癌細胞株(HT29、SW116、HCT116、DLD1、SW620和LS180)中ASPM蛋白表達，結果顯示SW116和HCT116細胞株中ASPM蛋白表達高于其他細胞株(圖1)。

圖1 不同結腸癌細胞株中ASPM蛋白表達：

2.2 siRNA-ASPM后轉染后，不同處理組中HCT116和SW116細胞內ASPM的表達選取兩種ASPM蛋白表達較高的HCT116和SW116結腸癌細胞作為實驗對象。HCT116和SW116細胞均設NC組、siRNA-ASPM-2559組、siRNA-ASPM-9315組、siRNA-ASPM-10413組和siRNA-ASPM-10049組。siRNA-ASPM轉染48 h后，HCT116細胞中，siRNA-ASPM-2559、siRNA-ASPM-9315、siRNA-ASPM-10413和siRNA-ASPM-10049組中ASPM mRNA相對表達量分別為0.24±0.02、0.12±0.01、0.77±0.02、0.61±0.05(圖2)，干擾效果分別為24.4%、11.9%、77.4%和61.1%。SW116細胞中，siRNA-ASPM-2559、siRNA-ASPM-9315、siRNA-ASPM-10413和siRNA-ASPM-10049組中ASPM mRNA相對表達量分別為0.47±0.03、0.22±0.02、0.39±0.04、0.69±0.03(圖3)，干擾效果分別為46.9%、22.0%、39.4%和69.1%。結果顯示，加入siRNA后，RT-PCR檢測顯示ASPM mRNA相對表達量空白組(HCT116和SW116均為1±0)與NC組(HCT116為1.16±0.01，SW116為1.10±0.02)中ASPM的表達差異無顯著性。故后續實驗未再設置空白組。

圖2 siRNA-ASPM轉染后，不同處理組中HCT116細胞內ASPM的表達變化

圖3 siRNA-ASPM轉染后，不同處理組中SW116細胞內ASPM的表達變化

2.3 siRNA-ASPM轉染后SW116和HCT16細胞的增殖siRNA-ASPM轉染后，siRNA組HCT116細胞和SW116細胞與NC組相比，細胞存活率明顯下降(P<0.05，圖4、5)。

圖4 siRNA-ASPM轉染后，不同處理組中HCT116細胞的存活率

圖5 siRNA-ASPM轉染后，不同處理組中的SW116細胞的存活率

2.4 siRNA-ASPM轉染后SW116和HCT116細胞的侵襲能力變化siRNA-ASPM轉染后，HCT116細胞中，siRNA-ASPM-2559組和siRNA-ASPM-9315組的Transwell小室下層細胞計數較NC組明顯減少(P<0.05，表1，圖6)。

圖6 siRNA-ASPM轉染后，不同處理組HCT116細胞的侵襲能力：

在SW116細胞中，siRNA-ASPM-9315組侵襲進入小室下層的細胞數較NC組明顯減少(P<0.05)；siRNA-ASPM-10413組進入小室下層的細胞數較NC組減少，但差異無統計學意義(P>0.05)(表1，圖7)。

表1 siRNA-ASPM轉染后HCT116和SW116細胞的侵襲能力

2.5 siRNA-ASPM轉染后HCT116和SW116細胞的凋亡siRNA-ASPM轉染后，HCT116細胞中siRNA-ASPM-2559組和siRNA-ASPM-9315組細胞凋亡率與NC組相比，均明顯升高(P<0.05，圖8)。SW116細胞中，siRNA-ASPM-9315組和siRNA-ASPM-10413組細胞凋亡率分別與NC組相比，凋亡率明顯上升，差異有顯著性(P<0.05，圖9)。

圖8 流式細胞術檢測沉默ASPM表達后HCT116細胞凋亡率：

圖9 流式細胞術檢測沉默ASPM表達后SW116細胞凋亡率：

2.6 siRNA-ASPM轉染后，HCT116細胞中ASPM和β-catenin的表達siRNA-ASPM轉染后，siRNA組HCT116細胞中ASPM和β-catenin水平與NC組相比，顯著降低(P<0.05，圖10)。

圖10 轉染siRNA-ASPM后，HCT116細胞中ASPM和β-catenin mRNA和蛋白的表達：

2.7 Wnt信號通路激活劑LiCl對β-catenin表達的影響qRT-PCR和Western bolt實驗結果證實，與siRNA-ASPM-2559組相比，siRNA-ASPM-2559+LiCl組能夠增加β-catenin mRNA的升高(P<0.05)；β-catenin蛋白表達水平亦有所增加，但差異無統計學意義(P>0.05，圖11)。

圖11 挽救實驗檢測加入LiCl后對β-catenin的表達的影響：

2.8 siRNA-ASPM轉染后，HCT116細胞質和細胞核中β-catenin蛋白表達為進一步觀察ASPM對β-catenin表達的影響，實驗選擇了沉默效果較好的siRNA-ASPM-2559探針進行轉染，進行核質分離實驗。轉染后，siRNA組HCT116細胞質和細胞核中β-catenin水平與NC組相比，均明顯降低(P<0.05，圖12)。

圖12 轉染siRNA-ASPM后，HCT116細胞質和細胞核中β-catenin蛋白表達：

3 討論

ASPM是果蠅有絲分裂紡錘體蛋白的人類同源基因[4]。ASPM編碼的蛋白是一種紡錘體極/中間體蛋白，其作用在于調節細胞有絲分裂的方向和胞質的分離[5]。在胰腺癌細胞中，將ASPM基因敲除，胰腺癌細胞的增殖和遷移能力均明顯下降[2]。在前列腺癌的研究中同樣發現，敲除ASPM后，前列腺癌細胞的增殖速度減慢，減少了處于S期的癌細胞的比例；同時，前列腺癌細胞的成球能力和侵襲能力亦下降明顯[6]。

本組實驗檢測了6株結腸癌細胞系(HT29、SW116、HCT116、DLD1、SW620和LS180)中ASPM的蛋白表達，結果顯示6株結腸癌細胞中ASPM蛋白表達不同，其中SW116和HCT116細胞中ASPM的蛋白表達最高。選擇ASPM蛋白含量較高的結腸癌細胞，進行siRNA轉染，48 h后，結腸癌細胞增殖和侵襲能力均明顯降低，但凋亡率升高，提示沉默ASPM基因可引發結腸癌細胞惡性生物學能力降低。

Wnt/β-catenin信號通路是胚胎發育過程中最重要的分子調節機制，同時在成熟組織中也調節了細胞的再生和平衡發展。多數結直腸癌中，均存在著由于細胞內的某些成分突變導致Wnt信號通路過度激活的現象。大部分結腸癌發生的核心步驟是Wnt信號通路中β-catenin在細胞質內無法降解，入核內聚集引發下游效應因子[7]。在胰腺癌PANC-1和AsPC-1細胞株中檢測發現，沉默ASPM后導致β-catenin蛋白水平持續降低[2]。但在前列腺癌的研究中發現ASPM是通過直接調節DVL3蛋白的穩定性間接影響了β-catenin的穩定性，免疫共沉淀實驗證實ASPM與DVL3具有相關性，而與β-catenin并無直接的相關性[6]。

本實驗結果顯示，干擾結腸癌細胞中ASPM的表達，細胞中β-catenin mRNA和蛋白的表達均降低。進一步行核質分離實驗后發現細胞質和細胞核內β-catenin的表達均顯著下降。挽救實驗中加入Wnt信號通路激活劑LiCl后，β-catenin mRNA的表達有所回升。蛋白表達雖有所回升，但差異無顯著性。由此推測ASPM可能通過調節β-catenin激活Wnt信號通路發揮作用，且對β-catenin在胞質中的聚集即開始發揮影響。但ASPM是直接影響了β-catenin的表達，還是作用于其上游調節因子間接影響了β-catenin的表達有待于進一步證實。在挽救實驗中，β-catenin mRNA水平有所恢復，但差異無顯著性，推測可能存在其他分子機制影響了轉錄后調控，是后續研究值得探索的現象。

綜上所述，ASPM維持了結腸癌細胞的惡性生物學行為。將ASPM沉默后結腸癌細胞HCT116增殖活性降低，細胞侵襲力下降，凋亡率升高，可能與ASPM引起β-catenin的異常表達有關，本實驗初步分析了ASPM對結腸癌表觀指標的影響，具體機制有待深入探討。