胰腺癌組織中SOX4和E-cadherin的表達及臨床意義

秦 雯，陳泰文，鄭海平，陶慧娟，朱小東

胰腺癌患者死亡的主要原因是早期癥狀不明顯，確診時癌細胞已向局部進展或遠處轉移，錯過最佳治療機會。因此，測定胰腺癌轉移的生物指標，明確其轉移機制，是臨床制定合理的胰腺癌抗腫瘤治療方案、改善胰腺癌患者預后的研究熱點之一。目前認為在癌癥背景下，上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)可以驅動腫瘤轉移[1-2]、腫瘤復發[3]和腫瘤治療耐藥[4]。腫瘤發生EMT的同時往往伴隨其相關分子標志物表達的變化，如在子宮內膜癌[5]、乳腺癌[6]、口腔鱗狀細胞癌[7-8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]、食管癌[11]、肺癌[12-13]等腫瘤中SOX4表達與EMT密切相關。此外，有研究推測在胰腺癌中，EMT可能催生了以E-cadherin下調、細胞骨架重組、運動和侵襲潛能為特征的癌細胞轉移表型，E-cadherin可能發揮著EMT軸標志物的作用[14]。目前胰腺癌組織中SOX4、E-cadherin蛋白表達及其臨床意義尚不明確，兩者之間的關系也不明確。本實驗采用組織芯片技術和免疫組化SP法檢測胰腺癌組織中SOX4和E-cadherin蛋白的表達，探討在胰腺癌發生和演進過程中EMT的改變，以進一步揭示胰腺癌的發生、發展機制。

1 材料與方法

1.1 材料收集2015年1月～2018年1月廣西醫科大學第一附屬醫院、廣西醫科大學附屬腫瘤醫院、廣西醫科大學附屬武鳴醫院收治的合計125例胰腺癌組織及對應癌旁正常胰腺組織，其中癌旁組織距癌灶距離>2 cm。125例經病理檢查證實均為胰腺導管腺癌，其中男性69例，女性56例，年齡(62.06±8.27)歲；患者術前均未接受任何輔助治療，其中病變位于胰頭者79例，位于胰體尾者46例；根據1997年國際抗癌聯盟(UICC)的病理分級標準：高、中、低分化胰腺導管腺癌分別為21、55、49例；腫瘤分期采用2018版美國癌癥聯合委員會(AJCC)推出的胰腺癌分期系統：Ⅰ期23例，Ⅱ期50例，Ⅲ期38例，Ⅳ期14例；伴淋巴結轉移者62例，無淋巴結轉移者63例。本實驗經廣西醫科大學附屬武鳴醫院倫理委員會批準同意。

1.2 組織芯片構建組織芯片制作實驗在廣西醫科大學實驗中心進行。依據HE染色切片選取相應的組織蠟塊，鏡下觀察切片，并確定具有代表性的病變部位。制作組織芯片的取樣針直徑1.5 mm，組織芯間距1.0 mm，使用的儀器為組織芯片構建儀(Beecher Instruments，Silver Spring, MD)。

1.3 免疫組化采用免疫組化SP法檢測SOX4及E-cadherin蛋白表達。兔抗人SOX4多克隆抗體和兔抗人E-cadherin多克隆抗體均購自Origene公司，SP免疫組化超敏試劑盒及DAB顯色劑均購自福州邁新公司。用PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照，用已知陽性標本作為陽性對照，具體操作步驟按試劑盒說明書進行。

1.4 結果判定SOX4以細胞核(或細胞核和細胞質)出現彌漫均勻的淡黃色至棕褐色顆粒為陽性，E-cadherin以細胞膜出現棕褐色的線狀染色為陽性。由兩名病理科醫師獨立完成閱片和判讀，每張切片隨機選取5個高倍視野，每個視野計數200個細胞。根據陽性細胞染色強度計分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。根據陽性細胞百分率計分：陽性細胞數≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，>75%為4分。將兩項得分結果相乘：0～2分為陰性，3～12分為陽性。

1.5 統計學分析采用SPSS 20.0軟件進行統計學處理。SOX4及E-cadherin表達與胰腺癌臨床病理特征的相關性采用χ2檢驗；SOX4與E-cadherin表達的相關性用Spearman秩相關檢驗；采用Kaplan-Meier生存曲線進行生存分析；單因素及多因素生存分析采用Cox比例風險模型。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胰腺癌組織和癌旁組織中SOX4、E-cadherin蛋白的表達SOX4蛋白表達主要定位于細胞核(或細胞核和細胞質)，呈彌漫均勻的淡黃色至棕褐色顆粒，E-cadherin蛋白表達主要定位于細胞膜，呈淡黃色至棕褐色(圖1)。125例胰腺癌組織中97例(77.6%)SOX4蛋白陽性，癌旁組織中15例(12.0%)SOX4蛋白陽性；125例胰腺癌組織中18例(14.4%)E-cadherin蛋白陽性，癌旁組織中103例(82.40%)E-cadherin蛋白陽性。胰腺癌組織中，SOX4蛋白陽性率高于癌旁組織，E-cadherin蛋白陽性率低于癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.05，表1)。

表1 胰腺癌組織及癌旁組織中SOX4及E-cadherin的表達[n(%)]

2.2 胰腺癌中SOX4、E-cadherin表達與臨床病理特征的關系胰腺癌組織中，SOX4蛋白表達與腫瘤大小、腫瘤部位、AJCC分期、淋巴結轉移、脈管內癌栓和神經侵犯相關(P<0.05)，與患者性別、年齡、腫瘤分化程度無關(P>0.05)。E-cadherin蛋白表達與腫瘤大小、腫瘤部位、腫瘤分化程度、AJCC分期、淋巴結轉移、脈管內癌栓和神經侵犯相關(P<0.05)，與患者性別、年齡無關(P>0.05，表2)。

表2 胰腺癌組織中SOX4、E-cadherin表達與臨床病理特征的關系[n(%)]

2.3 胰腺癌中SOX4和E-cadherin蛋白表達的相關性Spearman相關性分析顯示，SOX4和E-cadherin共同陽性者1例，共同陰性者11例，SOX4陽性而E-cadherin陰性者96例，SOX4陰性而E-cadherin陽性者17例，兩者在胰腺癌中的表達呈負相關(r=-0.763，P<0.001，表3)。

表3 胰腺癌中SOX4和E-cadherin表達的相關性

2.4 SOX4和E-cadherin蛋白表達與胰腺癌患者生存期的相關性Kaplan-Meier生存分析及Log-rank檢驗顯示，SOX4蛋白陽性或E-cadherin蛋白陰性患者的生存期顯著縮短(P<0.001，圖2)。Cox單因素分析顯示，腫瘤大小、分化程度、AJCC分期、淋巴結轉移、脈管內癌栓、神經侵犯、SOX4蛋白表達及E-cadherin蛋白表達與患者生存期有關(P<0.05)；Cox多因素分析顯示，AJCC分期、腫瘤大小、遠處轉移是影響患者生存的獨立預后因素(表4、5)。

表4 胰腺癌患者的Cox單因素相關性分析

表5 胰腺癌患者的Cox多因素相關性分析

圖2 Kaplan-Meier生存曲線分析SOX4(A)、E-cadherin(B)

3 討論

1982年Greenburg和Hay[15]首次描述了EMT，指靜止的、極化的上皮細胞“轉化”為高度運動的、伸長的間質細胞能力；并初步描述了EMT在胚胎期神經嵴、心內膜墊形成過程中的功能，以及在成人組織傷口愈合和組織重塑過程中的功能。有趣的是，不恰當地重新激活胚胎發育過程和成人組織生長過程的EMT，與人類惡性腫瘤的發生、發展有關。之后大量研究進一步證實，EMT是上皮細胞失去細胞極性和細胞黏附而獲得間質特征的過程，也是癌細胞獲得侵襲和遷移能力的首要環節[1-2]。當細胞發生EMT時，可能伴隨著其相關分子標志物的表達變化[16]。在多種腫瘤中SOX4、E-cadherin蛋白表達與EMT密切相關[5-14]。

Sox(Sry-related high-mobility group box)轉錄因子家族成員幾乎存在于所有的細胞、組織和器官中，在細胞生長和胚胎發育中發揮重要的功能。SOX4基因屬于SOX家族的C組成員，定位于6p22.3上，編碼一種由474個氨基酸組成的、主要定位于細胞核內的蛋白質，即SOX4蛋白。SOX4蛋白主要由N端HMG結構域和C端轉錄激活結構域(transactivation domain,TAD)組成，可通過高度保守的HMG結構域與DNA結合來激活或抑制靶基因的表達，也可與其他轉錄因子相互作用共同調節基因的表達。SOX4在多種腫瘤中過表達，并能通過調節EMT促進腫瘤的轉移。如在乳腺上皮細胞中SOX4參與了轉錄生長因子β(transforming grows factor β, TGF-β)介導的EMT，敲除SOX4基因則能夠阻斷EMT[6]。

E-cadherin是一種經典的鈣依賴性黏附分子家族成員，在正常組織和細胞的生長、分化、凋亡和形態學改變中發揮關鍵作用。E-cadherin蛋白促進相鄰細胞間穩定連接的形成，促進上皮細胞黏附，并保持組織結構和功能的完整性。此外，E-cadherin還能抑制腫瘤細胞分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)。因此，E-cadherin蛋白表達缺失降低了腫瘤細胞之間的相互黏附力，使其能夠突破細胞外基質和基膜，脫離原發腫瘤，發生侵入和轉移。E-cadherin作為一種非常敏感的EMT標志物，其表達與腫瘤細胞的浸潤和未分化表型有關，與早期腫瘤細胞的侵襲和轉移密切相關。E-cadherin表達下調被認為是EMT過程中的關鍵事件[14]。

EMT也是胰腺癌早期侵襲和轉移的重要分子機制。本實驗選擇胰腺癌作為研究對象，對EMT相關蛋白SOX4和E-cadherin表達進行檢測和分析，結果顯示，SOX4在胰腺癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織，且腫瘤臨床分期越高、腫瘤體積越大，其SOX4表達越高；此外，存在淋巴結轉移、脈管內癌栓或神經侵犯者，其SOX4表達亦增高。E-cadherin在胰腺癌組織中的表達明顯低于癌旁正常組織，且腫瘤臨床分期越高、腫瘤體積越大、腫瘤分化程度越低，其E-cadherin表達越低；此外，存在淋巴結轉移、脈管內癌栓或神經侵犯者，其E-cadherin表達也降低。這說明胰腺癌的發生是漸進的過程，SOX4和E-cadherin可能參與胰腺癌的發展和轉移，且兩者在胰腺癌組織中的變化趨勢相反。生存分析顯示，SOX4蛋白陰性組與陽性組相比具有生存優勢，生存期相對延長；E-cadherin蛋白陽性組與陰性組相比具有生存優勢，生存期相對延長。Cox單因素生存分析亦顯示，EMT相關蛋白SOX4及E-cadherin的表達與患者生存期有關。因此，有可能通過聯合檢測SOX4及E-cadherin表達來判斷胰腺癌的預后。此外，EMT過程具有可塑性，可通過誘導間質-上皮轉化(mesenchymal-epithelial transition, MET)來逆轉。因此，增強對EMT如何啟動和逆轉，以及如何調控的認識，對于降低腫瘤轉移相關的病死率至關重要。

綜上所述，利用組織芯片和免疫組化法檢測胰腺癌組織中EMT相關蛋白SOX4及E-cadherin的表達，不僅為進一步揭示胰腺癌的發生、發展機制及患者預后判斷提供參考依據，而且在調控和逆轉EMT、預防和治療胰腺癌方面也具有重要的臨床指導意義。