參芎葡萄糖注射液抗H9c2細胞凋亡的機制*

吳忠秀，陸定艷，楊暢，何彬，李勇軍，王永林，劉亭**

(1.貴州醫科大學 貴州省藥物制劑重點實驗室 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學 藥學院，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學 民族藥與中藥開發應用教育部工程研究中心 &省部共建藥用植物功效與利用國家重點實驗室，貴州 貴陽 550004)

隨著人們生活水平的改變以及不均衡膳食營養的攝入，心血管系統疾病如高血壓、高血脂、冠心病、心絞痛及動脈粥樣硬化等發病率逐年上升，嚴重影響人們的健康以及生活質量，同時這也是導致中老年人死亡的原因之一[1-2]。因此，心血管系統疾病的預防、治療和診斷至關重要。有研究表明，氧化應激會導致動脈粥樣硬化、心絞痛、急性心肌梗死等一系列心血管疾病[3]，而心肌細胞凋亡是心肌細胞氧化損傷的重要表現形式之一，所以預防或治療心血管疾病的關鍵是抗細胞凋亡[4-5]。參芎葡萄糖注射液(shenxiong glucose injection，SGI)是由丹參提取物和鹽酸川芎嗪組成的注射液，收載于衛生部藥品標準[6]，其具有較強的抗氧化應激和抗凋亡作用[7-8]，主要含有丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、鹽酸川芎嗪、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B、丹酚酸I/H、紫草酸、丹酚酸C以及Genipin 12種已知成分，及一種未知成分[9]，在臨床上，SGI對冠心病、心絞痛、腦梗死等閉塞性腦血管病及其它缺血性心血管疾病的防治具有確切療效，且無明顯毒副作用[9-10]。但迄今為止，SGI抗細胞凋亡的作用機制仍不清楚。本文擬采用網絡藥理學技術預測SGI抗細胞凋亡的作用靶點，并構建過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導H9c2細胞凋亡模型驗證SGI拮抗H2O2誘導H9c2細胞凋亡的相關機制，為SGI的進一步深入開發提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞與實驗試劑 H9c2大鼠心肌細胞株由中科院上海細胞庫提供。參芎葡萄糖注射液(批號H52020703，500 mL/瓶)購自貴州景峰注射劑有限公司，H2O2(批號20140803，GR，國藥集團化學試劑有限公司)，DMEM高糖培養基(批號8128032)、胎牛血清(FBS，批號1237698)、胰蛋白酶(批號J130089)均購自Gibco公司，青霉素-鏈霉素(批號15140-122)、RIPA細胞裂解液(含PMSF蛋白酶抑制劑，批號20141219)、磷酸鹽緩沖液(PBS粉末，自配)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(批號20140722)均購自Solarbio公司，JC-1線粒體膜電位檢測試劑盒(批號20150314)購自美國Sigma公司，兔抗Cyt-c多抗(批號AC63325)、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG (批號AB01151)購自巴傲得生物科技有限公司。

1.1.2實驗儀器 CO2細胞培養箱(Thermo scientific公司),TS100倒置顯微鏡(Nikon公司)、Allegra 64R冷凍高速離心機(美國Beckman),Model 680酶標儀、BD FACSCanto II流式細胞儀(美國BD公司),ChemiDoc XRS+凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1SGI作用靶點信息獲取 利用中藥系統藥理學平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology platform，TCMSP)，選擇CAS搜索框，輸入SGI的丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸C、Genipin的CAS號檢索相關靶點；在SwissTarget Prediction數據庫的檢索框中輸入鹽酸川芎嗪、丹酚酸B、紫草酸和丹酚酸I/H的SMILES格式檢索靶點。見表1。

1.2.2京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)通路富集和基因本體(gene ontology，GO)功能注釋 運用DAVID數據庫(database for annotation,visualizationand integrated discovery,DAVID)平臺進行GO功能注釋和KEGG的通路富集分析，再通過Hiplot科研數據可視化平臺進行數據柱狀圖可視化。見表1。

表1 數據分析數據庫(軟件)及對應的網址Tab.1 Data analysis database/software and corresponding websites

1.2.3SGI預處理對H2O2誘導的H9c2細胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的影響 取對數生長期的H9c2細胞，用含完全培養基將細胞密度調整為10×104個/mL于100 mm培養皿中，每皿10 mL，在37 ℃、5% CO2培養箱中培養40 h。將細胞分為Con組、H2O2組以及SGI(低、中、高)濃度組(以主要成分鹽酸川芎嗪為濃度計量，濃度分別為100、200、400 μmol/L)，先用PBS 4 mL洗兩次，Con組和H2O2組加入完全培養基，SGI低、中、高濃度組分別加入含有100、200、400 μmol/L SGI的完全培養基，各組于37 ℃、5% CO2培養箱中培養6 h后，吸出藥液，用DMEM無血清培養基4 mL洗滌細胞2次。Con組加入10 mL無血清DMEM培養基，SGI組和H2O2組和中每孔加入H2O2濃度為300 μmol/L的無血清培養基，孵育0.5 h，PBS 4 mL 洗2次，胰蛋白酶消化液1 mL消化1 min，再加入完全培養基5 mL重懸細胞，收集細胞待用；按照線粒體膜電位檢測試劑盒說明書標記細胞，處理后待機上樣，利用流式細胞術檢測細胞內MMP的變化。

1.2.4SGI預處理對H2O2誘導的H9c2細胞內細胞色素C(cytochrome C，Cyt-c)的含量影響 取對數生長期的H9c2細胞，用含完全培養基將細胞密度調整為10×104個/mL于100 mm培養皿中，每皿10 mL，在37 ℃、5%CO2培養箱中培養40 h。依據“1.2.3”給藥方法處理細胞，吸出液體，取PBS 4 mL 緩沖液潤洗2遍，加入RIPA細胞裂解液200 μL(含1%PMSF)，冰上裂解至黏稠狀，轉移至1.5 mL離心管中，渦混30 s，冰上靜止5 min，重復該步驟1～2次，將裂解液在4 ℃離心機離心10 min，轉速為12 000 r/min得到總蛋白，取少量用于測定蛋白質濃度，剩余的加入6×Buffer煮沸變性，Western blot實驗檢測Cyt-c表達情況。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行數據的分析處理，組間差異比較采用單因素方差分析(One-WayANOVA)，兩組間比較用t檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 SGI作用靶點信息獲取

以SGI的12個成分為關鍵詞進行檢索得到相關靶點142個，其中丹參素20個、原兒茶醛9個、咖啡酸9個、丹酚酸D 2個、丹酚酸A 34個、丹酚酸C 1個、Genipin 9個、鹽酸川芎嗪13個、丹酚酸B 15個、紫草酸15個和丹酚酸I/H 15個，主要包含絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase 1,MAPK1)、胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase-3)、蛋白激酶1 (protein kinase 1,Akt1)等。

2.2 KEGG通路富集

運用DAVID平臺進行KEGG通路富集分析結果顯示，KEGG通路富集到90條信號通路，其中MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路和p53信號通路與Cyt-c的釋放密切相關。

2.3 GO功能注釋

運用DAVID平臺進行GO功能注釋結果顯示，富集到生物過程(biological process，BP)409條、細胞組分(cellular component，CC)59條以及分子功能(molecular function，MF)67條，其中主要富集的線粒體、線粒體外膜以及細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase1/2，ERK1/2)信號通路的激活等，均與MMP調節和Cyt-c釋放緊密相關。

圖1 SGI相關靶點KEGG通路富集Fig.1 Enrichment of KEGG pathway related targets of SGI

圖2 SGI相關靶點GO功能分析Fig.2 GO function analysis of related targets of SGI

2.4 SGI預處理對H2O2誘導H9c2 MMP的影響

與Con組MMP熒光強度(21 059±1 237)比較，H2O2組H9c2細胞內MMP熒光強度為(5 298±457)，明顯降低(P<0.001)；與H2O2組比較，SGI組低、中、高濃度組H9c2細胞MMP的熒光強度明顯升高(P<0.001)，熒光強度分別為10 087±957、14 962±1 420、18 680±1 045。由此可見，H2O2損傷H9c2細胞MMP熒光強度顯著降低，而SGI低、中、高組均能夠明顯抑制H2O2誘導的H9c2細胞MMP的降低。見圖3。

2.5 SGI預處理對H2O2誘導的H9c2細胞中Cyt-c的影響

與Con組比較，H2O2組H9c2細胞中Cyt-c蛋白表達明顯升高(P<0.001)；與H2O2組比較，SGI低、中、高濃度組Cyt-c蛋白表達明顯降低(P<0.001)。見圖4。

注：(1)與Con組比較，P<0.001；(2)與H2O2組比較，P<0.001。圖4 SGI對H2O2誘導H9c2細胞Cyt-c蛋白表達的影響Fig.4 Effect of SGI on Cyt-c protein expression in H9c2 cells induced by H2O2

注：A為Con組，B為H2O2組，C為SGI低濃度組，D為SGI中濃度組，E為SGI高濃度組，F為結果統計；(1)與Con組比較，P<0.001；(2)與H2O2組比較，P<0.001。圖3 SGI對H2O2誘導H9c2細胞MMP的影響Fig.3 The effect of SGI on MMP in H9c2 cells induced by H2O2

3 討論

細胞凋亡是一種細胞自主的程序性死亡，受基因的調控，在細胞和機體的生長、繁殖和發育中起著關鍵作用，同時也與人類的重大疾病相關[5]。有研究表明心肌梗死、缺血性心臟病、再灌注損傷等各種心血管系統疾病與細胞凋亡密切相關[11]，其中氧化應激在心肌細胞凋亡中起重要作用。當氧化與抗氧化平衡傾向氧化作用時，會產生大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，如H2O2會刺激線粒體釋放Cyt-c，從而導致心肌細胞凋亡[12-13]。因此抗心肌細胞凋亡是治療心血管系統疾病主要途徑之一。

心肌細胞凋亡途徑主要包括死亡受體途徑、線粒體途徑[5,14]和內質網途徑[15]。有研究發現在病理狀態下，線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，MPTP)大量開放，而MPTP與MMP的穩定、凋亡蛋白的釋放等密切相關[16-17]，它的非特異性開放會導致線粒體受損以及Cyt-c釋放，從而激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)級聯反應，導致細胞凋亡和促凋亡因子的釋放，進而導致細胞凋亡或壞死[18-19]。MAPK信號通路主要由3條并行信號通路組成，分別是線粒體外膜以及細胞外信號調節蛋白激酶(extracellular signal regulated protein kinase，ERK)通路、c-Jun N-末端激酶(c-Jun N-terminal protein kinase,JNK)通路和p38通路[20]。JNK和p38在各種細胞應激因子的刺激下被磷酸化激活，在誘導促凋亡蛋白Bax表達的同時抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達，從而導致Bax介導的線粒體凋亡途徑；而ERK1/2的激活不但可以上調Bcl-2等抗凋亡蛋白的表達[21]，還能減少Cyt-c從線粒體釋放到胞質從而抑制心肌細胞凋亡的發生[22-24]。PI3K-AKT信號通路在細胞的增殖和凋亡中起著重要作用，AKT磷酸化后可調控Bcl-2、Bax以及Cyt-c等的表達，從而發揮抗細胞凋亡的作用[25-26]。本研究對SGI的12個成分進行KEGG通路富集后，發現SGI與MAPK信號通路、PI3K-AKT信號通路密切相關；GO功能注釋結果顯示，SGI主要富集在線粒體、線粒體膜電位調節等，與MMP調節和Cyt-c的釋放密切相關[3,11]，同時SGI的靶點MAPK1、Caspase-3、Akt1等也與線粒體有關[27-29]。本實驗研究發現，與模型組比較，SGI低、中、高濃度組均能顯著升高H9c2細胞的MMP和明顯下調Cyt-c的表達，這與網絡藥理學的分析一致，提示SGI可能是通過線粒體途徑抑制心肌細胞凋亡從而發揮治療疾病的作用。

綜上所述，SGI可通過上調MMP和降低Cyt-c的釋放調控線粒體途徑，從而產生抗心肌細胞凋亡的作用，但其具體機制還有待進一步研究。