蛇床子素抑制NLRP3炎癥體及對血管性癡呆大鼠的神經保護作用研究

張 放 汪玲紅 王祥云 黃 櫻

（贛南醫學院第一臨床醫學院，江西 贛州 341000）

0 引言

血管性癡呆（Vascular Dementia，VD）是可導致認知障礙的一類疾病，產生的機制主要有細胞焦亡（Pyroptosis）、中樞膽堿能系統的破壞、炎癥反應、氧化應激損傷等[1]。其中，細胞焦亡與VD發病的關系漸受關注。研究表明，細胞焦亡的發生發展始于Caspase-1的激活，而Caspase-1的激活受NOD樣受體（NLR）的調控。構成NLRs的關鍵成員：NOD樣受體家族熱蛋白結構域3（NLRP3），被認為是將血管疾病與神經炎癥和腦部疾病緊密聯系的樞紐，在其中發揮著重要作用[2]。

蛇床子素（Osthole）是一種呋喃香豆素，具有抑制抗氧自由基損傷、抗炎及改善記憶的作用[3，4]。既往發現，皮層組織中的NLRP3炎性體在慢性腦缺血的炎癥反應中起著關鍵作用。本文從動物體內實驗著手，探討蛇床子素是否能通過抑制NLRP3炎性體激活而抵抗癡呆，進而深入探討蛇床子素的機制作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用潔凈環境成長的雄性SD大鼠（重量150～180 g，n=30，贛南醫學院SPF動物房供給的健康大鼠）。

1.2 藥物、試劑和儀器

凝膠成像儀、電泳儀（Bio-Rad）；蛇床子素粉劑（成都埃法生物科技有限公司）；PCR儀（ABI）；NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18和β-actin（Abcam）。

1.3 實驗動物造模、分組及給藥

用改良的兩側頸總動脈永久性結扎術制備VD動物模型。隨機將大鼠平均分為五組：假手術、VD模型、蛇床子素干預組（10，25，40 mg/kg）。鼠麻醉蘇醒后向其腹腔注射藥物，1天1次，共給藥12周。其余組生理鹽水同法等量給予。

1.4 Morris水迷宮測試

能夠成功找到水中臺子的規定時間是120 s。大鼠找到臺子實際所需的時間是逃避潛伏期（EL）。

1.5 熒光實時定量PCR

總RNA用Trizol加至組織樣本來提出，加逆轉錄試劑，反應體系為20μL，置于儀器中反應擴增。引物設計及合成由公司完成（上海生工生物）。

1.6 蛋白質印跡法（Western blot）

加RIPA裂解大鼠海馬組織，四度離心機處理，上清用于后續操作；以BCA（bicinchoninic acid）方式定量蛋白。SDS-聚丙烯酰胺膠（10%～12%）分離，轉膜后蛋白封閉1 h，4度冰柜一抗過夜，于室溫孵二抗1 h，常規化學法顯影。

1.7 統計學方法

數據統計用SPSS23.0，計量資料的結果用均數±標準差呈現。單因素方差分析統計各個組之間數據，P<0.05有統計學意義。

2 結果

2.1 蛇床子素對VD大鼠認知功能的作用

定位航行結果顯示，VD組大鼠EL（46.6438.371s）較假手術組（23.0245.125s）時間延長（P<0.05）；蛇床子素治療各組大鼠的EL與VD組相比均縮短，但仍高于假手術組；治療組組間比較提示，中劑量組大鼠的EL（36.3302.534s）、高劑量組大鼠的EL（34.2254.326s）顯著低于低劑量組大鼠的EL（40.2892.112s），P<0.05；但蛇床子素高、中兩組EL相比，P>0.05。

2.2 蛇床子素對VD大鼠海馬組織中IL-1β、caspase-1、IL-18、NLRP3的mRNA和蛋白表達的影響

PCR結果顯示（見表1），VD組海馬中IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3 mRNA的表達較假手術組增加；蛇床子素各組與VD組相比，可明顯抑制以上所述mRNA的表達量，P<0.05。

表1 各組大鼠IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3 mRNA的相對表達量

通過Western blot實驗（見表2），VD組較假手術組海馬中IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3蛋白表達增加。同時，低劑量組海馬中的上述蛋白的表達與VD組相比均減少，而中、高兩組減少地更明顯，P<0.05。

表2 各組大鼠IL-1β、caspase-1、IL-18和NLRP3蛋白的相對表達量

3 討論

研究報道，在正常細胞內環境中，NLRP3會抑制其自身的寡聚化，而被細菌、病毒、ATP、β淀粉樣蛋白、活性氧等多種內外因素干擾后，NLRP3被激活。NLRP3激活后Caspase-1前體可被ASC（一類蛋白質）所募集，可進一步活化Caspase-1，促使IL-1β、IL-18等關鍵性致炎因子的成熟，并且其他免疫細胞被喚醒，進而增加趨化等下游因子活性，最終加劇炎性反應，引起焦亡[5]。在生理情況下，細胞焦亡是機體受到外界病原體刺激或自身內源性損傷后引發的一種免疫防御，它能夠高效拮抗和清除內、外病原損傷刺激[6]。但是VD可被長時程的、過度的細胞焦亡誘導發病[7]。

據文獻報道，天然香豆素類化合物及合成的衍生物是一類新型的神經保護劑，有抗氧化性，能抑制并除去ROS（活性氧），減輕氧自由基引起的損害等[8]。蛇床子素如前所述是一種呋喃香豆素。Zhang X Q等[9]研究顯示，蛇床子素能增加SOD的活性，減少丙二醛（MDA）和NO的產生。Chen Z等[10]的研究證實，蛇床子素可激活Nrf2/HO-1信號通路。本研究發現，蛇床子素能改善VD大鼠的認知行為功能，且能降低海馬組織中NLRP3、IL-1β、caspase-1和IL-18蛋白和mRNA的表達。故推測，VD大鼠認知行為的改善可能是由蛇床子素通過抑制NLRP3炎癥體激活所致。其具體的作用機制尚需進一步研究，但本研究為蛇床子素在VD治療中發揮作用提供了新的思路和實驗證據。