生豬養殖中非洲豬瘟病毒分子流行病學監測與分析

顧叢叢

（山東省桓臺縣畜牧漁業服務中心 256400）

1 材料

1.1 采樣用品

磷酸鹽緩沖保護液（含有30%甘油和10%雙抗）、一次性使用滅菌棉拭子、75%酒精、1.5ml EP 管、EDTAk2 無菌抗凝管、記號筆、冰袋、封口袋、剪刀、記號筆、防護服、口罩、防護帽、手套等。

1.2 主要試劑和儀器

病毒DNA/RNA 提取試劑盒（4.0），西安天龍科技有限公司生產。非洲豬瘟病毒熒光PCR 檢測試劑盒，本試劑盒采用Taqman 探針實時熒光聚合酶鏈式反應（Real time PCR），對非洲豬瘟病毒核酸進行定性或定量檢測，深圳真瑞生物科技有限公司生產。全自動核酸提取儀是西安天龍科技有限公司生產的NP968 -C，熒 光 定 量 PCR 儀 器 是 Applied Biosystems QuantStudio 3，生物安全柜是Thermo Fisher Scientific Model 1389。

2 采樣

2.1 采樣依據

本次采樣主要根據《2020 年淄博市非洲豬瘟監測實施方案》 《關于加強病死豬無害化處理環節非洲豬瘟風險管控的通知》 《2020 年桓臺縣縣級動物疫病監測方案》 等。

2.2 樣品要求

固體環境樣品應放置在加有PH7.2 PBS 的1.5ml EP 管中，液體樣品直接放在1.5ml EP 管中，不得少于1ml/管。每頭豬的樣品應單獨包裝、編號，同一場點的樣品應再加外包裝，防止滲漏，樣品運輸過程中應盡量保持低溫。

每家養豬場戶采集兩欄豬舍的樣品，包括豬糞：四角及中心位置每欄采集5 份拭子，放入1 個采樣管中；污水：每欄采集1 份，不低于1ml/份；眼鼻拭子、肛門拭子：每欄采集2 頭豬的拭子，同一頭豬的眼鼻拭子、肛門拭子放入同一個EP 管中。病死豬的樣品采集肛門拭子放入EP 管中，抗凝血樣品主要采集了兩家養殖場，每家養豬場戶采集30 份抗凝血，每頭豬不少于5ml/管。

2.3 樣品采集

本次樣品采集針對縣域內的生豬養殖場戶，從2020 年1～12 月，連續監測12 個月。重點采集了病死豬樣品，特別是出現發燒、咳嗽、扎堆、腹瀉、呼吸困難、關節腫脹、皮膚潰爛、耳朵發紺等癥狀、經治療無效的死亡豬的肛門拭子樣品，其次，每月采集7 家年出欄量在2000 頭以下生豬養殖場戶的樣品，包括豬糞、污水、眼鼻拭子、肛門拭子、EDTAk2 抗凝血樣品，共采集樣品約450 余份。

2.4 樣品處理

檢測前樣品應在二級生物安全柜中處理。棉拭子樣品加入1mL 的0.01mol/L PBS (pH7.2)，取出棉拭子，13000rpm 離心10min，保留上清備用；污水樣品10000rpm 離心10min，保留上清備用；豬糞樣品于EP 管中加入1ml 滅菌生理鹽水，混勻，10000rpm 離心10min，保留上清備用。抗凝血樣品取1ml 放入EP 管中，10000rpm 離心10min，保留上清備用。將上述處理的樣品置于60℃條件下滅活30min。

2.5 樣品保存

采集或處理好的樣品在2～8℃條件下保存應不超過24h；如需長期保存，應放置-70℃冰箱，但應避免反復凍融(凍融不超過3 次)。

3 檢測步驟

3.1 核酸提取

3.1.1 預封裝試劑準備

從試劑盒中取出真空包裝的預封裝試劑，顛倒混勻數次使磁珠重懸，去掉真空包裝，輕甩孔板，使試劑及磁珠均集中到孔板底部，使用前小心撕去鋁箔封口膜，避免振動，防止液體濺出。

在預封裝試劑的第1 或7 列中分別加入20μl 蛋白酶K 溶液，200μl 樣本，陰陽性對照無需進行核酸提取處理，可直接用于熒光PCR 檢測。

NP968 系列核酸提取儀按以下程序進行自動化提取。

（1）移磁，混合時間1min，磁吸時間10s，溫度0℃。

（2）裂解，混合時間5min，磁吸時間45s，90℃裂解加熱。

（3）洗滌1，混合時間2min，磁吸時間30s，90℃洗脫加熱。

（4）洗滌2，混合時間1min，磁吸時間20s，90℃洗脫加熱。

（5）洗滌3，混合時間1min，磁吸時間20s，90℃洗脫加熱。

（6）洗脫，混合時間5min，磁吸時間35s，90℃洗脫加熱。

（7）棄磁，混合時間1min，磁吸時間0s，溫度0℃。

自動化程序結束后，將第6 或12 列的洗脫液轉移至干凈的無核酸酶離心管中。

3.1.2 試劑配制

取ASFV 核酸熒光PCR 檢測混合液（n×22.5μl）與Taq 酶（n×0.4μl）混合，震蕩混勻數秒，3000rpm 離心數秒。

3.1.3 加樣

取上數混合液22.5μl 于PCR 反應管中，然后將陰性對照品、已處理樣品、陽性對照品各2.5μl 分別加入PCR 反應管中，蓋好PCR 反應管蓋，立即進行PCR 擴增反應。

3.1.4 PCR 擴增

反應管置于定量熒光PCR 儀上，采用常規模式，94℃，2min，循環數1；93℃，15s，60℃，60s，循環數40。單點熒光檢測在60℃，熒光通道檢測選擇：FAM，passive reference 和quencher 處選擇none。

3.1.5 基線和閾值設定

基線調整取6～15 個循環的熒光信號，閾值設定原則以閾值線剛好超過陰性對照品的最高點。

3.1.6 結果成立條件

陽性對照品：CT 值≤35。陰性對照品：未檢出。以上需求需要同時滿足，否則本次試驗無效，需要重新進行，參見附表。

附表 CT值評價標準表

4 結果

每月檢測一次，對450 余份樣品檢測結果均為陰性，未檢出ASFV 核酸。監測曲線，見附圖。

附圖 ASFV核酸監測曲線圖

5 討論

經過為期12 個月的監測，全縣養殖場戶的環境樣品，如豬糞、污水非洲豬瘟監測均為陰性，肛門、眼鼻拭子也均為陰性，該結果與恒臺縣有效防控非洲豬瘟的工作落實有關。這些工作措施如下。

（1）宣傳教育到位。縣防控指揮部利用專題會、明白紙、宣傳畫、廣播電視、微信平臺等，廣泛宣傳非洲豬瘟的防控知識，消除養殖場戶的恐慌心理，增強防控信心，推動非洲豬瘟防控工作開展。

（2）疫情排查到位。非洲豬瘟防控工作抓早抓小是關鍵，做到早發現、早診斷、早處置，全縣八個鄉鎮配備20 余名專業技術人員，33 名村級動物防疫員按照各自的防疫責任區域，每天1 排查、2 報告，做到排查不漏戶（場）、排查有簽字、現場有記錄。

（3）全程監管到位。各項防控措施安排及時得當、鄉鎮疫情排查上報及時、基層畜牧獸醫防控技術宣傳指導到位、動物衛生檢疫檢測到位、公路檢查站、生豬產品市場監管到位。

（4）檢疫檢驗到位，縣動物疫病預防與控制中心投資一百余萬元，擴建了分子生物學實驗室，為全縣非洲豬瘟的監測提供了強有力的技術保障。此外，有效的宣傳使恒臺縣部分生豬規模養殖場對疾病認識非常到位，自我提高生物安全辦廠要求，自費購買熒光PCR 儀等設備，對生豬、豬舍污染物、飼料、養殖環境等進行日常監測，投入的同時也帶來了巨大的經濟效益。

（5）物質保障到位。物質經費保障是做好非洲豬瘟防控工作的重要保障，村防疫人員的薪資全部納入財政支付，全縣各項應急物資儲備，生活設施、車輛運行、生活補助，督查人員的車輛運行，防控指揮部印發各項防控資料、宣傳材料、防控明白紙，應急無害化處置補助等經費支出，雖然數量很大，均能及時撥付。

生豬養殖過程中非洲豬瘟的防控工作不是一個單獨部門或養殖環節的工作，需要養殖過程中的各部門及飼養環節相互聯合，做好聯防聯控工作才能做好非洲豬瘟防控工作。