機會性感染病原體對新發艾滋病患者抗病毒治療過程中T 淋巴細胞亞群分布影響的隊列研究

黃 山，呂松琴，段洪芬，施金麗，李光敏，黃 崗，李佳能，李曉非

（昆明市第三人民醫院，云南省傳染性疾病臨床醫學中心，云南 昆明 650041）

高效抗逆轉錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy，HAART）能有效抑制HIV 復制并減少病毒變異[1]，進而重建或者改善艾滋病患者免疫功能，絕大多數患者經 HAART 后，免疫功能恢復正常或接近正常水平[2]，但不規范的治療[3]、個體差異[4]以及患者依從性[5]等因素，也會導致治療失敗。本文探討新發艾滋病患者高效抗逆轉錄病毒治療過程中外周血T 淋巴細胞亞群分布，通過隊列研究旨在觀察機會性感染的病原體是否對抗病毒治療過程中的患者T 淋巴細胞亞群分布產生影響，為艾滋病的防治提供一些數據支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年1 月1 日至2020 年6 月30 日昆明市第三人民醫院感染一科收治的初次確診[6]且未經抗病毒治療的艾滋病患者220 例，隨訪1 a無失訪病例，其中男性158 名，女性62 名，年齡（43.24±12.11）歲，依據《中國艾滋病診療指南（2018 版）》[7]經臨床診斷，220 例中艾滋病合并結核分枝桿菌33 例，艾滋病合并丙型肝炎病毒30 例，艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌31 例，其余病例中艾滋病合并1 種病原體45 例，艾滋病合并2 種病原體30 例，艾滋病合并3 種及以上病原體51 例，治療方案為富馬酸替諾福韋二吡呋酯片+拉米夫定+依非韋倫（TDF+3TC+EFV），分別于治療前、治療3、6、12 個月采集患者抗凝血樣本，采用流式細胞術檢測患者外周血T 淋巴細胞亞群。本研究經昆明市第三人民醫院倫理委員會審核通過，臨床試驗嚴格遵循赫爾辛基宣言和中國有關臨床試驗研究規范、法規進行。

1.2 主要儀器與試劑

單克隆熒光抗體CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5、溶血素OptiLyse C、FlowCount 計數微球、Lymphosure 質控品、稀釋液、Flow-Check Fluorospheres 流式細胞儀光路與流路校準物、BECKMAN Navios? Flow Cytometer 流式細胞儀均購自美國Beckman Coulter 公司。

1.3 方法

流式細胞術檢測外周血T 淋巴細胞亞群。患者空腹于早上7:00～9:00 用EDTA-K2 抗凝管行無菌穿刺術采集靜脈血4 mL，24 h 內檢測。取流式試管，用反向加樣法加入100 μL 抗凝全血；加入相對應的四色抗體10 μL，渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min；取出試管，每管加入500 μL OpitiLyse C，渦旋混勻，室溫避光放置10 min；取出試管，每管加入500 Μl PBS，室溫平衡5 min；取出Flow-Count 熒光微球，渦旋震蕩混勻10～12 s；以反向加樣法在試管中加入100 μL 熒光微球；充分渦旋混勻，2 h 內上機檢測。每次開機用Flow-Check Fluorospheres 對流式細胞儀進行光路與流路校準，記錄前向散射光（FS）和各熒光信號的半峰變異系數（HPCV）值，追蹤一定時間內HPCV 的變化，要求變異系數（CV）值控制在2%～3%，以確保儀器處于穩定狀態，保證實驗的一致性和穩定性。每天用Lymphosure 質控品進行一次室內質控，操作與樣本相同，以保證檢測結果的可靠性。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 艾滋病合并機會性感染病原體患者抗病毒治療過程中T 淋巴細胞亞群分布特征

艾滋病合并結核分枝桿菌（以下簡稱“AIDS/TB”）、艾滋病合并丙型肝炎病毒（以下簡稱“AIDS/HCV”）和艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌（以下簡稱“AIDS/TM”）3 組患者T 淋巴細胞亞群檢測數據經單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗存在非正態分布數據（P<0.001），采用Kruskal Wallis檢驗比較分析，結果顯示，3 組患者在治療3 個月后CD3+、CD8+和CD4+T 淋巴細胞計數都明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），除了AIDS/TM 組治療6 個月后CD4+T 淋巴細胞計數再次明顯升高，其余2 組3 項指標隨后治療過程中無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）。治療1 后3 組患者的CD3+和CD8+T 淋巴細胞計數差異無統計學意義（P>0.05）；而AIDS/HCV 組CD4+T 淋巴細胞計數要高于其它2 個組，差異有統計學意義（P<0.05）。治療過程中3 組患者的CD3+/淋巴細胞和CD8+/淋巴細胞百分比無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；而AIDS/TB 和AIDS/TM 組CD4+/淋巴細胞百分比在治療3 個月后明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；同時3 組患者1 的治療過程中CD4+/CD8+比值都 <1（表1、圖1。）

表1 AIDS/TB、AIDS/HCV、AIDS/TM 三組患者抗病毒治療過程中T 淋巴細胞亞群分布特征[（，M（P25，P75）]Tab.1 The distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy [，M（P25，P75）]

表1 AIDS/TB、AIDS/HCV、AIDS/TM 三組患者抗病毒治療過程中T 淋巴細胞亞群分布特征[（，M（P25，P75）]Tab.1 The distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy [，M（P25，P75）]

備注：AIDS/TB 33例；AIDS/HCV 30例；AIDS/TM 31例。

2.2 艾滋病合并感染單個及多種病原體患者抗病毒治療過程中T 淋巴細胞亞群分布特征

艾滋病合并 1 種病原體（以下簡稱“AIDS/1”）、艾滋病合并2 種病原體（以下簡稱“AIDS/2”）和艾滋病合并3 種及以上（以下簡稱“AIDS/≥3”），3 組患者T 淋巴細胞亞群檢測數據經單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗也存在非正態分布數據（P<0.001），采用Kruskal Wallis檢驗比較分析，結果顯示AIDS/1 組抗病毒治療3 個月后CD3+和CD8+T 淋巴細胞計數明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05），整個治療過程中CD4+T 淋巴細胞計數無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；AIDS/2 組治療6 個月后CD3+及治療3 個月后CD8+T 淋巴細胞計數明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；AIDS/≥3 組治療6 個月后，CD3+和CD8+T 淋巴細胞計數才明顯升高；AIDS/2和AIDS/≥3 組在治療3、6 個月后CD4+T 淋巴細胞計數明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）。治療1 a 后3 組患者的CD3+和CD8+T 淋巴細胞計數無明顯差異，差異無統計學意義（P>0.05）；而AIDS/1 組CD4+T 淋巴細胞計數要高于其它2 個組，差異有統計學意義（P<0.05）。治療過程中3 組患者的CD3+/淋巴細胞和CD8+/淋巴細胞百分比無明顯變化，差異無統計學意義（P>0.05）；而AIDS/≥3 組CD4+/淋巴細胞百分比在治療3 個月后明顯升高，差異有統計學意義（P<0.05）；同時3 組患者1 a 的治療過程中CD4+/CD8+比值都 <1（表2、圖2）。

圖2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三組患者T 淋巴細胞分布特征比較分析Fig.2 Comparative analysis the distribution characteristics of T lymphocyte with 3groups

表2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三組患者抗病毒治療過程中T 淋巴細胞亞群分布特征[，M（P25，P75）]Tab.2 the distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy[，M（P25，P75）]

表2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三組患者抗病毒治療過程中T 淋巴細胞亞群分布特征[，M（P25，P75）]Tab.2 the distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy[，M（P25，P75）]

備注：AIDS/1 45例；AIDS/2 30例；AIDS/≥3 51例。

3 討論

HAART 的出現提高了艾滋病患者生存年限的同時也改善了患者的生活質量，使得艾滋病重新被定義為一種像高血壓、糖尿病需終身服藥的慢性病[8]，但查閱國家統計局數據[9]，近年艾滋病死亡人數及死亡率在甲乙類法定報告傳染病中仍高居榜首，其中不規范的抗病毒治療，患者依從性及HIV 耐藥[10]等因素是造成患者死亡的主要原因，及早的發現、規范的治療是HARRT 成功與否的關鍵[11]。

在HAART 過程中T 淋巴細胞亞群的檢測尤其是CD4+T 淋巴細胞計數是判斷患者疾病進展[12]、制定臨床用藥方案[13]、評價治療效果和預后[14]的重要指標。基于筆者前期的研究基礎[15]，本文對云南地區艾滋病機會性感染病原體中細菌占比第一的艾滋病合并結核分枝桿菌、病毒占比第一的艾滋病合并丙型肝炎病毒、真菌占比第三的艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌及感染不同數量病原體患者在HAART 過程中的T 淋巴細胞亞群分布進行了分析發現，抗病毒治療初期由于體內機會性感染病原體的存在細胞特異性免疫響應更為快速，CD8+T 淋巴細胞計數明顯上升，而且不論患者CD3+和CD8+T 淋巴細胞計數處于何種水平，經過規范的治療后，兩項指標都能恢復到同等水平與機會性感染病原的種類和感染數量無關。而艾滋病患者治療前T 淋巴細胞亞群分布水平的高低和機會性感染病原體的種類及數量會影響治療過程中CD4+T 淋巴細胞計數的恢復速度和水平，艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌和艾滋病合并2 種、合并3 種及以上病原體的患者CD4+T 淋巴細胞計數在治療3 和6 個月后都出現了明顯的升高，但治療1 a 后CD4+T 淋巴細胞計數僅為200 個/μL 左右。新發艾滋病患者的T 淋巴細胞亞群分布水平越低，抗病毒治療的效果顯現越慢，免疫功能的重建及恢復耗時越長，但治療的前3 個月是評估治療效果好壞的關鍵期，大部分患者CD3+和CD8+T 淋巴細胞計數等指標都會發生明顯變化，對于治療不佳患者應考慮HIV 耐藥及患者依從性或考慮調整用藥方案。最后CD4/CD8 在治療前、中、后比值都 <1，并不是一個理想的治療效果評估指標。

研究的不足之處：（1）納入的樣本量及病原體種類較少；（2）沒有對HIV 載量進行比較分析。筆者將在今后的研究中加大樣本量與病原體種類，開展HIV 載量的檢測及對比分析。