機會性感染病原體對新發(fā)艾滋病患者抗病毒治療過程中T 淋巴細(xì)胞亞群分布影響的隊列研究

黃 山，呂松琴，段洪芬，施金麗，李光敏，黃 崗，李佳能，李曉非

（昆明市第三人民醫(yī)院，云南省傳染性疾病臨床醫(yī)學(xué)中心，云南 昆明 650041）

高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療（highly active antiretroviral therapy，HAART）能有效抑制HIV 復(fù)制并減少病毒變異[1]，進而重建或者改善艾滋病患者免疫功能，絕大多數(shù)患者經(jīng) HAART 后，免疫功能恢復(fù)正?；蚪咏Ｋ絒2]，但不規(guī)范的治療[3]、個體差異[4]以及患者依從性[5]等因素，也會導(dǎo)致治療失敗。本文探討新發(fā)艾滋病患者高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療過程中外周血T 淋巴細(xì)胞亞群分布，通過隊列研究旨在觀察機會性感染的病原體是否對抗病毒治療過程中的患者T 淋巴細(xì)胞亞群分布產(chǎn)生影響，為艾滋病的防治提供一些數(shù)據(jù)支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2019 年1 月1 日至2020 年6 月30 日昆明市第三人民醫(yī)院感染一科收治的初次確診[6]且未經(jīng)抗病毒治療的艾滋病患者220 例，隨訪1 a無失訪病例，其中男性158 名，女性62 名，年齡（43.24±12.11）歲，依據(jù)《中國艾滋病診療指南（2018 版）》[7]經(jīng)臨床診斷，220 例中艾滋病合并結(jié)核分枝桿菌33 例，艾滋病合并丙型肝炎病毒30 例，艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌31 例，其余病例中艾滋病合并1 種病原體45 例，艾滋病合并2 種病原體30 例，艾滋病合并3 種及以上病原體51 例，治療方案為富馬酸替諾福韋二吡呋酯片+拉米夫定+依非韋倫（TDF+3TC+EFV），分別于治療前、治療3、6、12 個月采集患者抗凝血樣本，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測患者外周血T 淋巴細(xì)胞亞群。本研究經(jīng)昆明市第三人民醫(yī)院倫理委員會審核通過，臨床試驗嚴(yán)格遵循赫爾辛基宣言和中國有關(guān)臨床試驗研究規(guī)范、法規(guī)進行。

1.2 主要儀器與試劑

單克隆熒光抗體CD45-FITC/CD4-PE/CD8-ECD/CD3-PC5、溶血素OptiLyse C、FlowCount 計數(shù)微球、Lymphosure 質(zhì)控品、稀釋液、Flow-Check Fluorospheres 流式細(xì)胞儀光路與流路校準(zhǔn)物、BECKMAN Navios? Flow Cytometer 流式細(xì)胞儀均購自美國Beckman Coulter 公司。

1.3 方法

流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血T 淋巴細(xì)胞亞群?；颊呖崭褂谠缟?:00～9:00 用EDTA-K2 抗凝管行無菌穿刺術(shù)采集靜脈血4 mL，24 h 內(nèi)檢測。取流式試管，用反向加樣法加入100 μL 抗凝全血；加入相對應(yīng)的四色抗體10 μL，渦旋混勻，室溫避光放置15～20 min；取出試管，每管加入500 μL OpitiLyse C，渦旋混勻，室溫避光放置10 min；取出試管，每管加入500 Μl PBS，室溫平衡5 min；取出Flow-Count 熒光微球，渦旋震蕩混勻10～12 s；以反向加樣法在試管中加入100 μL 熒光微球；充分渦旋混勻，2 h 內(nèi)上機檢測。每次開機用Flow-Check Fluorospheres 對流式細(xì)胞儀進行光路與流路校準(zhǔn)，記錄前向散射光（FS）和各熒光信號的半峰變異系數(shù)（HPCV）值，追蹤一定時間內(nèi)HPCV 的變化，要求變異系數(shù)（CV）值控制在2%～3%，以確保儀器處于穩(wěn)定狀態(tài)，保證實驗的一致性和穩(wěn)定性。每天用Lymphosure 質(zhì)控品進行一次室內(nèi)質(zhì)控，操作與樣本相同，以保證檢測結(jié)果的可靠性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 艾滋病合并機會性感染病原體患者抗病毒治療過程中T 淋巴細(xì)胞亞群分布特征

艾滋病合并結(jié)核分枝桿菌（以下簡稱“AIDS/TB”）、艾滋病合并丙型肝炎病毒（以下簡稱“AIDS/HCV”）和艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌（以下簡稱“AIDS/TM”）3 組患者T 淋巴細(xì)胞亞群檢測數(shù)據(jù)經(jīng)單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗存在非正態(tài)分布數(shù)據(jù)（P<0.001），采用Kruskal Wallis檢驗比較分析，結(jié)果顯示，3 組患者在治療3 個月后CD3+、CD8+和CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)都明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），除了AIDS/TM 組治療6 個月后CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)再次明顯升高，其余2 組3 項指標(biāo)隨后治療過程中無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。治療1 后3 組患者的CD3+和CD8+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而AIDS/HCV 組CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)要高于其它2 個組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。治療過程中3 組患者的CD3+/淋巴細(xì)胞和CD8+/淋巴細(xì)胞百分比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而AIDS/TB 和AIDS/TM 組CD4+/淋巴細(xì)胞百分比在治療3 個月后明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；同時3 組患者1 的治療過程中CD4+/CD8+比值都 <1（表1、圖1。）

表1 AIDS/TB、AIDS/HCV、AIDS/TM 三組患者抗病毒治療過程中T 淋巴細(xì)胞亞群分布特征[（，M（P25，P75）]Tab.1 The distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy [，M（P25，P75）]

表1 AIDS/TB、AIDS/HCV、AIDS/TM 三組患者抗病毒治療過程中T 淋巴細(xì)胞亞群分布特征[（，M（P25，P75）]Tab.1 The distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy [，M（P25，P75）]

備注：AIDS/TB 33例；AIDS/HCV 30例；AIDS/TM 31例。

2.2 艾滋病合并感染單個及多種病原體患者抗病毒治療過程中T 淋巴細(xì)胞亞群分布特征

艾滋病合并 1 種病原體（以下簡稱“AIDS/1”）、艾滋病合并2 種病原體（以下簡稱“AIDS/2”）和艾滋病合并3 種及以上（以下簡稱“AIDS/≥3”），3 組患者T 淋巴細(xì)胞亞群檢測數(shù)據(jù)經(jīng)單樣本Kolmogorov-Smirnov檢驗也存在非正態(tài)分布數(shù)據(jù)（P<0.001），采用Kruskal Wallis檢驗比較分析，結(jié)果顯示AIDS/1 組抗病毒治療3 個月后CD3+和CD8+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），整個治療過程中CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；AIDS/2 組治療6 個月后CD3+及治療3 個月后CD8+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；AIDS/≥3 組治療6 個月后，CD3+和CD8+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)才明顯升高；AIDS/2和AIDS/≥3 組在治療3、6 個月后CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。治療1 a 后3 組患者的CD3+和CD8+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)無明顯差異，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而AIDS/1 組CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)要高于其它2 個組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。治療過程中3 組患者的CD3+/淋巴細(xì)胞和CD8+/淋巴細(xì)胞百分比無明顯變化，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）；而AIDS/≥3 組CD4+/淋巴細(xì)胞百分比在治療3 個月后明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；同時3 組患者1 a 的治療過程中CD4+/CD8+比值都 <1（表2、圖2）。

圖2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三組患者T 淋巴細(xì)胞分布特征比較分析Fig.2 Comparative analysis the distribution characteristics of T lymphocyte with 3groups

表2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三組患者抗病毒治療過程中T 淋巴細(xì)胞亞群分布特征[，M（P25，P75）]Tab.2 the distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy[，M（P25，P75）]

表2 AIDS/1、AIDS/2、AIDS/≥3 三組患者抗病毒治療過程中T 淋巴細(xì)胞亞群分布特征[，M（P25，P75）]Tab.2 the distribution characteristics of T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients in 3groups during antiviral therapy[，M（P25，P75）]

備注：AIDS/1 45例；AIDS/2 30例；AIDS/≥3 51例。

3 討論

HAART 的出現(xiàn)提高了艾滋病患者生存年限的同時也改善了患者的生活質(zhì)量，使得艾滋病重新被定義為一種像高血壓、糖尿病需終身服藥的慢性病[8]，但查閱國家統(tǒng)計局?jǐn)?shù)據(jù)[9]，近年艾滋病死亡人數(shù)及死亡率在甲乙類法定報告?zhèn)魅静≈腥愿呔影袷?，其中不?guī)范的抗病毒治療，患者依從性及HIV 耐藥[10]等因素是造成患者死亡的主要原因，及早的發(fā)現(xiàn)、規(guī)范的治療是HARRT 成功與否的關(guān)鍵[11]。

在HAART 過程中T 淋巴細(xì)胞亞群的檢測尤其是CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)是判斷患者疾病進展[12]、制定臨床用藥方案[13]、評價治療效果和預(yù)后[14]的重要指標(biāo)。基于筆者前期的研究基礎(chǔ)[15]，本文對云南地區(qū)艾滋病機會性感染病原體中細(xì)菌占比第一的艾滋病合并結(jié)核分枝桿菌、病毒占比第一的艾滋病合并丙型肝炎病毒、真菌占比第三的艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌及感染不同數(shù)量病原體患者在HAART 過程中的T 淋巴細(xì)胞亞群分布進行了分析發(fā)現(xiàn)，抗病毒治療初期由于體內(nèi)機會性感染病原體的存在細(xì)胞特異性免疫響應(yīng)更為快速，CD8+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)明顯上升，而且不論患者CD3+和CD8+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)處于何種水平，經(jīng)過規(guī)范的治療后，兩項指標(biāo)都能恢復(fù)到同等水平與機會性感染病原的種類和感染數(shù)量無關(guān)。而艾滋病患者治療前T 淋巴細(xì)胞亞群分布水平的高低和機會性感染病原體的種類及數(shù)量會影響治療過程中CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)的恢復(fù)速度和水平，艾滋病合并馬爾尼菲籃狀菌和艾滋病合并2 種、合并3 種及以上病原體的患者CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)在治療3 和6 個月后都出現(xiàn)了明顯的升高，但治療1 a 后CD4+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)僅為200 個/μL 左右。新發(fā)艾滋病患者的T 淋巴細(xì)胞亞群分布水平越低，抗病毒治療的效果顯現(xiàn)越慢，免疫功能的重建及恢復(fù)耗時越長，但治療的前3 個月是評估治療效果好壞的關(guān)鍵期，大部分患者CD3+和CD8+T 淋巴細(xì)胞計數(shù)等指標(biāo)都會發(fā)生明顯變化，對于治療不佳患者應(yīng)考慮HIV 耐藥及患者依從性或考慮調(diào)整用藥方案。最后CD4/CD8 在治療前、中、后比值都 <1，并不是一個理想的治療效果評估指標(biāo)。

研究的不足之處：（1）納入的樣本量及病原體種類較少；（2）沒有對HIV 載量進行比較分析。筆者將在今后的研究中加大樣本量與病原體種類，開展HIV 載量的檢測及對比分析。