ICAM-1、MMP-9 及NF-κB 在膽管癌中的表達及與外周血免疫抑制細胞的關系

李志強，高紅強，李鏡鋒，余杰琦，王冬冬，陳 剛，褚 光

（昆明醫科大學附屬甘美醫院肝膽胰外科，云南 昆明 650224）

肝內膽管癌是一種來源于肝內膽管上皮細胞的惡性腫瘤，具有高度惡性、高病死率、低診斷率特點，嚴重威脅患者生命健康[1?2]。我國膽管癌發病率為0.01%～0.46%，且調查顯示其占惡性腫瘤總數的2%，好發于中老年人。由于膽管癌早期容易侵襲周圍組織器官以及出現遠處轉移是預后差、手術切除率低的根本原因，目前診斷和治療水平尚無取得突破性進展，且具體病機制尚未完全明確，而從腫瘤生物學角度尋求更好的預防以及治療方法是研究熱點[3?4]。近年來研究發現，細胞間粘附分子-1（ICAM-1）、基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）及NF-κB 與惡性腫瘤發生、發展密切相關[5?6]。髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）是近年來發現的具有免疫調節功能的一類免疫細胞亞群，在自身免疫、炎癥及腫瘤中發揮重要作用。本文研究旨在探討ICAM-1、MMP-9 及NF-κB 在膽管癌中的表達及與外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取昆明醫科大學附屬甘美醫院于2017 年12 月至2019 年12 月收治的膽管癌患者60 例研究對象，均行根治性手術治療，且均經病理學證實，患者均未采取抗腫瘤治療，及3 個月未使用免疫抑制劑。60 例患者中，男性38 例，女性22 例；年齡36～78 歲，平均（58.39±10.21）歲；臨床分期：I～II 期19 例，III～IV 期41 例；病理分級：低分化34 例，中高分化26 例；淋巴結轉移21 例。經昆明醫科大學附屬甘美醫院倫理委員會審查同意開展研究。

診斷標準：依據《膽管癌診斷與治療--外科專家共識》[7]關于肝內膽管癌診斷標準，臨床表現出現腹部不適、腹痛、上腹腫塊、乏力、惡心、發熱等，經超聲檢查證實肝內局限性腫塊。納入標準：（1）符合肝內膽管癌診斷標準，均行根治性手術治療，且經病理學證實為肝內膽管癌；（2）均未采取抗腫瘤治療；（3）3 個月未使用免疫抑制劑。排除標準：（1）其他類型膽管癌及合并其他惡性腫瘤者；（2）臨床資料和隨訪資料不完整。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：鼠抗人ICAM-1 抗體，兔抗MMP-9 單克隆抗體，兔抗NF-κB 單克隆抗體，均購自武漢博士德生物試劑公司。主要儀器：美國BD 公司流式細胞儀。

1.3 方法

（1）免疫組織化學技術檢測ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白：取患者癌組織和癌旁正常組織標本，經10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，4 μm 厚連續切片，按照免疫組化SP 法進行實驗操作，檢測ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白，以PBS 代替一抗作為陰性對照，試劑公司提供的陽性著色圖片為陽性對照。于光學顯微鏡下觀察染色結果，著色的結果判定采用半定量法，首先以細胞著色強弱度評分[1]：以無著色者為計分0 分，以淺黃色者為計分1 分，以棕黃色者計分為2 分，以棕褐色者計分為3 分。且記錄鏡下陽性細胞數所占的百分比：無陽性細胞者為計分0 分，陽性細胞≤10%者為計分1 分，陽性細胞數為計分11%～50%者為計分2 分，在51%～75%者為計分4 分。再按照上述兩者所得評分相乘結果劃分等級：其中以積分≤3 分即為“-”，以積分3～5 分為“+”，以積分5～8 分為“++”，以積分9～12 分則為“+++”[1]。

（2）流式細胞術檢測外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例：所有研究對象均于入院第2 d 清晨空腹采集患者3 mL 外周靜脈血，以肝素抗凝，取抗凝全血100 μL，以紅細胞裂解液充分裂解后，根據試劑盒說明書量取不同熒光標記抗體直接標記，對外周血 CD14、CD11b 和HLADR 抗原表達檢測，且標記同型對照，放置于4 ℃下避光孵育30 min，采用流式緩沖液洗滌2 次后上機檢測。圈取CD14+CD11b+的細胞群，再選擇HLA-DR-細胞群即為MDSC。

1.4 觀察指標

（1）觀察膽管癌組織與癌旁組織ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達；（2）觀察不同病理特征ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB蛋白表達；（3）觀察不同病理特征外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比 例；（4）分 析ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達與外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例相關性。

1.5 統計學處理

采用統計學軟件SPSS 22.0 進行數據處理分析，計數資料比較采用χ2檢驗，以率表示，計量資料比較采用t檢驗，以均數±標準差表示。采用Pearson 相關性分析 ICAM-1 蛋白、MMP-9蛋白及NF-κB 蛋白表達與CD14+CD11b+HALDR-MDSC 比例相關性。以P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 膽管癌組織與癌旁正常組織ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達比較

膽管癌組織ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達陽性率均高于癌旁正常組，差異均有統計學意義（P<0.05），見表1 和圖1～圖3。

表1 膽管癌組織與癌旁正常組織ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白和NF-κB 蛋白表達比較[n（%）]Tab.1 Comparison of ICAM-1 protein,MMP-9 protein and NF-κ B protein expression between cholangiocarcinoma and adjacent normal tissues [n（%）]

圖1 ICAM-1 蛋白表達（HE，×200）Fig.1 ICAM-1 protein expression（HE，×200）

圖2 MMP-9 蛋白表達（HE，×200）Fig.2 MMP-9 protein expression（HE，×200）

圖3 NF-κB 蛋白表達（HE，×200）Fig.3 NF-κB protein expression（HE，×200）

2.2 不同病理特征ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白、NF-κB 蛋白以及CD14+CD11b+HAL-DRMDSC 表達比較

不同性別、年齡、病理分級和淋巴結轉移ICAM-1 蛋白表達比較無明顯差異（P>0.05）；III～IV 期ICAM-1 蛋白表達陽性率高于I～II 期（P<0.05）。不同性別、年齡、病理分級和臨床分期MMP-9 蛋白表達比較無明顯差異（P>0.05）；淋巴結轉移MMP-9 蛋白表達陽性率高于無淋巴結轉移（P<0.05）。不同性別、年齡、病理分級和淋巴結轉移NF-κB 蛋白表達比較無明顯差異（P>0.05）；III～IV 期NF-κB 蛋白表達陽性率高于I～II 期（P<0.05）。不同性別、年齡、病理分級和淋巴結轉移CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例比較無明顯差異（P>0.05）；III～IV 期CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例高于I～II 期（P<0.05），見表2。

表2 不同病理特征ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白、NF-κB 蛋白以及CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 表達比較[n（%）]Tab.2 Comparison of ICAM-1 protein MMP-9 protein NF-κB protein and NF-κB protein expression in different pathological features [n（%）]

2.3 ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白表達與CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例相關性

ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋 白表達與CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例呈線性正相關，見表3。

表3 ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白表達與CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例相關性Tab.3 Expression of ICAM-1 protein,MMP-9 protein and NF- κB protein and its correlation with the proportion of CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC

3 討論

膽管癌是常見的一種膽道惡性腫瘤，通常情況下其癥狀出現晚，且具有較高發病率和病死率，嚴重威脅患者生命健康[7?9]。因此，采取及時有效的診斷和治療膽管癌方法尤為重要。

ICAM-1 人體正常組織中表達極低，僅某些淋巴細胞、上皮細胞少量表達。ICAM-1 主要通過街道腫瘤細胞與白細胞黏附，導致原發腫瘤分離和壞死，增加轉移和浸潤；血循環中瘤細胞/白細胞結合體，容易在毛細血管床滯留著床[10]。通常情況下，高表達ICAM-1 瘤細胞經人淋巴細胞功能相關抗原（LFA-1）結合，從而抑制免疫細胞對腫瘤細胞的殺滅和識別[11]。此外，ICAM-1 參與腫瘤與基質的粘附，以及促進癌細胞生長和轉移，并且與膽管癌預后關系緊密[12]。本文研究發現，膽管癌患者膽管癌組織中ICAM-1 高表達，且于臨床分期密切相關。基質金屬蛋白酶（MMPs）是形成和影響腫瘤微環境的一種蛋白水解酶家族，其中MMP-9 是MMPs 中分子量最大成員。MMP-9 最初主要以酶原形式分泌而產生，而其被激活后形成IV 型膠原酶，使腫瘤表面細胞外基質和基底膜降解、破壞，且可使IV、V、VII 和X 型膠原降解，以及使腫瘤細胞沿缺失的基膜浸潤周圍，而造成腫瘤細胞的侵襲和轉移，進而促進演變惡性腫瘤[13?15]。研究報道顯示，MMP-9 的陽性表達與膽管癌組織分化程度、臨床分期和轉移復發呈正相關[16]。而本文研究發現，膽管癌患者膽管癌組織中MMP-9 高表達，且與淋巴結轉移密切相關，而與上述研究存在一些差異，其原因可能是由于本文樣本量相對較少，還需后續增加樣本量進一步研究。NF-κB 是細胞內重要的一種轉錄因子，通常于靜息狀態下以異源或同源二聚體形式與抑制蛋白結合存在于細胞質中，當細胞受外源性刺激，抑制蛋白與NF-κB 剝離，進入細胞核，從而發揮其調控作用[17]。研究報道顯示，NF-κB 是腫瘤與連續持續炎癥的重要中介因子[18]。此外，研究報道顯示，NF-κB 在膽管癌組織中呈過表達，以及其在腫瘤組中表達水平高于正常組與膽管結石炎癥組[19]。本文研究發現，膽管癌患者膽管癌組織NF-κB 高表達，且與臨床分期密切相關。MDSC 是近年來研究發現的具有免疫調節功能一種免疫細胞亞群，能夠通過多種途徑抑制機體的免疫應答反應、且在移植免疫、炎癥、腫瘤及自身免疫中發揮重要作用。同時，MDSC 限制腫瘤免疫治療的效果，且參與腫瘤的免疫逃逸。研究報道顯示，腫瘤患者外周血中免疫抑制細胞的比例增加，且可促進腫瘤的免疫逃逸[20]。本文研究發現，膽管癌患者中外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例升高，且與臨床分期密切相關。

綜上所述，ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白表在膽管癌中高表達，外周血中CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例升高，且ICAM-1 蛋白、MMP-9 蛋白及NF-κB 蛋白表達與CD14+CD11b+HAL-DR-MDSC 比例呈線性正相關。