降鈣素受體、維生素D 受體基因多態性與昆明地區2 型糖尿病合并骨質疏松的關系

牛 玲 ，李博一 ，張 程 ，馬 蓉 ，唐 艷 ，劉 方 ，尹利民 ，韓竺君 ，苗翠娟 ，張 嫻

（1）昆明市第一人民醫院內分泌科；2）檢驗科，云南 昆明 650011）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）患者易同時合并骨質疏松癥（osteoporosis，OP）。由于骨質疏松導致的骨折和骨折致殘嚴重影響患者生活，同時給家庭、社會帶來沉重經濟負擔。因此重視防治糖尿病性骨質疏松對于糖尿病患者的生活質量改善具有重要意義。遺傳是T2DM 和OP 重要的發病因素，有研究認為糖尿病性骨質疏松是一種多基因遺傳病，這些基因[1]包括降鈣素受體（calcitonin receptor，CTR）基因、維生素D 受體（vitamin dreceptor，VDR）基因及護骨素基因等.對糖尿病性骨質疏松的單一基因研究較多，但不同基因間的聯合研究較少，而且結論不一。本研究旨在探討CTR 聯合VDR 基因多態性與昆明地區T2DM 伴骨質疏松癥的關系，以期為昆明地區T2DM 伴骨質疏松癥的防治提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象

隨機抽樣選取2017 年6 月至2019 年1 月在昆明市第一人民醫院內分泌科住院治療的2 型糖尿病患者237 例，其中男性122 例，女性115 例，年齡50～84 歲，平均（64.68±7.92）歲。2 型糖尿病診斷標準采用2013 年版《中國2 型糖尿病防治指南》標準診斷糖尿病[2]。骨質疏松癥診斷標準采用2011 年版《原發性骨質疏松癥診治指南》標準診斷[3]，按T 值評分診斷骨質疏松。所有入選的2 型糖尿病患者在昆明地區居住時間均大于10 a。排除標準：（1）1 型糖尿病，繼發性糖尿病；（2）各種糖尿病急性并發癥、伴有感染、營養不良、嚴重心腦及肝腎疾病、腫瘤患者；（3）皮膚疾病無法接受陽光照射者；（4）甲狀腺手術史，合并其他可能引起甲狀腺激素代謝異常的其他內分泌、免疫系統疾病、結締組織病者，如垂體瘤、垂體功能減退者，亞急性甲狀腺炎等；（5）存在類風濕或風濕或關節炎，且應用激素類藥物時間超過6 個月，或曾經接受活性維生素D、降鈣素、雌激素受體調節劑等影響骨代謝的藥物治療者；（6）存在畸形性骨關節炎者和成骨不全患者。納入的研究對象均簽署知情同意書，且本研究經昆明市第一人民醫院醫學倫理學委員會批準。

1.2 分組

（1）將237 例患者按骨密度檢測結果分為糖尿病無骨質疏松癥61 例；糖尿病合并骨量減少111 例；糖尿病伴骨質疏松65 例。

（2）將237 例患者按CTR 及VDR 基因型進行組合，共有6 種類型，分別為CCBB 型28 例，CCBb 型142 例，CCbb 型11 例，CTBB 型3 例，CTBb 型42 例，CTbb 型11 例，隨后經卡方檢驗，據檢驗結果進行合并，最后分為三種組合型：CC+BB 型28 例，CC+Bb、bb 型153 例，CT+BB、Bb、bb 型56 例。

1.3 研究方法

1.3.1 一般指標記錄年齡、性別、糖尿病病程，男性是否吸煙，男性是否飲酒。測試當日由專人用固定體重/身高測量儀測定：體重、身高、計算體重指數（BMI），單位kg/m2。

1.3.2 血壓指標采用汞柱式標準袖帶血壓表，受試者入院時休息5 min 后測定坐位右上臂收縮壓（SBP）/舒張壓（DBP），單位mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）。

1.3.3 其他生化指標受試者隔夜禁食8～12 h，入院第二天清晨6 點30 分-8 點取靜脈血測空腹血糖（FPG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、肝腎功能電解質（血鈣）、血脂、尿酸（UA）、維生素D 濃度、雌激素水平、睪酮水平，超敏C 反應蛋白（Hs-CRP）、纖維蛋白原（FIB）。按標準方法行OGTT試驗，檢測OGTT-0h、2 h 血糖，采用化學發光法測定0 h、2 h 胰島素（INS）水平（單位：mIU/L）。再采用穩態模型評估胰島素抵抗指數（HOMA-IR）：HOMA-IR=FINS X FPG/22.5，FINS 單位為mIU/L，FPG 即OGTT-0 h，單位為mmol/L。低的HOMAIR 示高胰島素敏感性，而高的HOMA-IR 表示胰島素敏感性差，存在胰島素抵抗。

1.3.4 外周血基因組DNA 提取空腹采集靜脈血6～8 mL，EDTA 抗凝，-80 ℃保存，標本收集結束后購進DNA 提取試劑盒統一提取CTR、VDR 基因。所需試劑及儀器為：DNA 提取試劑盒，購于AXYGEN 公司；DNA 聚合酶（2×Taq Master Mix）購于Bioteke 公司，引物由昆明碩擎公司合成；普通PCR 儀購于美國應用生物系統公司（型號ABI2720）；各種規格的離心管、槍尖、PCR 管、一次性乳膠手套和口罩購于NSET 公司。

1.3.5 PCR 擴增（1）PCR 基因擴增所使用的引物，見表1；（2）PCR 反應體系：25 μL 混勻液體。包括2XTaq PCR Master Mix 12.5 μL，PCR Forward Primer（10 μM，碩擎）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM，碩 擎）1 μL，Template DNA 4 μL，Nuclease-freeWater 8.5 μL；（3）PCR 反應條件：共35 個循環，95 ℃預變性5 min，然后95 ℃變性30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸60 s，反應完成后，72 ℃再延伸10 min；（4）酶切鑒定基因型：CTR 基因的PCR 擴增產物用AluⅠ內切酶酶切后，VDR 基因的PCR 擴增產物用BsmⅠ酶酶切后，置于2%瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。

表1 PCR 擴增所使用的引物Tab.1 The primer PCR amplification

1.3.6 骨密度測量采用通用電氣醫療系統（中國）有限公司生產的雙能X 線骨密度儀（型號DPX Bravo）測量腰椎L1-L4、股骨頸、髖部骨密度及T 值評分（BMD），單位g/cm2。

1.4 統計學處理

所有數據均使用SPSS11.5 軟件包進行統計處理。采用Hardy-Weinberg 平衡檢測基因型的分布是否具有代表性。正態分布計量資料用均數±標準差（）表示，3 個獨立樣本比較，采用方差分析，組間比較用最小有意義差異法（LSD 檢驗）。非正態分布計量資料用M（P25，P75）表示，采用秩和檢驗。計數資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗。采用多因素Logistic 回歸分析篩選獨立危險因素，P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組人群一般資料比較

3 組人群一般資料總體比較，結果顯示：性別、年齡、吸煙、飲酒、DBP、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮差異均有統計學意義（P<0.05）。且在兩兩比較時，T2DM 伴骨質疏松組與無骨質疏松組比較，上述指標均有統計學差異（P<0.017），見表2。

表2 研究對象的一般資料比較 [/M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study objects [/M（P25，P75）]

表2 研究對象的一般資料比較 [/M（P25，P75）]Tab.2 Comparison of general data of study objects [/M（P25，P75）]

*P <0.05。

2.2 CTR 及VDR 基因型

2.2.1 CTR 基因型酶切電泳圖結果顯示：CTR基因AluI 酶切位點多態性確定為：純合子CC 型228 bp 一條帶 ；雜合子CT 型228 bp 和120 bp兩條帶；純合子 TT 型120 bp 一條帶，見圖1。

圖1 CTR 基因型酶切電泳圖Fig.1 CTR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.2 VDR 基因型酶切電泳圖結果顯示：VDR基因Bsm I 酶切位點多態性確定為:純合子BB 型825 bp 一條帶 ；雜合子Bb 型825 bp、675 bp、150 bp 三條帶；純合子bb 型675 bp、150 bp 兩條帶，見圖2。

圖2 VDR 基因型酶切電泳圖Fig.2 VDR genotypes enzyme electrophoresis figure

2.2.3 CTR 聯合VDR 基因型分布情況CTR、VDR 基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡定律，說明所選人群代表性好。在237 例人群中，CTR聯合VDR 基因型分布情況為：以CCBb 型為主（142 例、占60.0%），其次為CCBB 型28 例（11.8%），CCbb 型11 例（4.6%），CTBB 型3 例（1.3%），CTBb 型42 例（17.7%），CTbb 型11 例（4.6%）。隨后按2 型糖尿病無骨質疏松癥組，合并骨量減少組，骨質疏松組分3 組，6 個基因組合經卡方檢驗，據檢驗結果進行合并，最后分為三種組合型：CC+BB 型28 例，CC+Bb、bb 型153 例，CT+BB、Bb、bb 型56 例。

2.2.4 3 組人群CTR 聯合VDR 基因型組合比較結果顯示：3 組人群VDR 聯合CTR 基因型組合CCBB 型，CC+Bb、bb 型，CT+BB、Bb、bb 型比較，無統計學差異（χ2=1.604，P=0.808），見表3。

表3 CTR 聯合VDR 基因型分布頻率比較[n（%）]Tab.3 CTR system joint VDR genotypes distribution frequency comparison [n（%）]

2.3 CTR 聯合VDR 基因型組合與2 型糖尿病患者BMD 的關系

結果顯示：237 例T2DM 患者中，VDR 聯合CTR 的不同基因型組合在各部位的BMD 值差異均無統計學意義（P>0.05），見表4。

表4 VDR 聯合CTR 基因多態性與2 型糖尿病患者BMD 的關系（g/cm2）（）Tab.4 The relationship between the CTR system joint VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients（g/cm2）（）

表4 VDR 聯合CTR 基因多態性與2 型糖尿病患者BMD 的關系（g/cm2）（）Tab.4 The relationship between the CTR system joint VDR gene polymorphism and BMD of T2DM patients（g/cm2）（）

2.4 多因素Logistic 回歸分析結果

將VDR 及CTR 基因型組合（1 為CCBB 型，2 為CC+Bb、bb 型，3 為CT+BB、Bb、bb 型）及單因素分析3 組間具有統計學差異的變量，即性別（0 為女，1 為男）、年齡、吸煙（0 為無，1 為有）、飲酒（0 為無，1 為有）、DBP、身高、體重、BMI、HDL-C、雌激素、睪酮作為自變量，糖尿病有無骨質疏松作為因變量（0 為無，1 為有），進行多因素Logistic 回歸分析，以篩選糖尿病伴骨質疏松的獨立危險因素。結果顯示：僅年齡（OR1.089、98%CI：1.033～1.148、P=0.002）、可以進入回歸方程，見表5。

表5 Logistic 回歸分析結果Tab.5 Logistic analysis results

3 討論

國內有報道[4]，近1/3 的糖尿病患者同時合并骨質疏松癥。然而，T2DM 伴骨質疏松癥的發病機制非常復雜，糖尿病高血糖狀態、糖基化終末產物（AGEs）、糖尿病慢性并發癥、氧化應激損傷、炎癥因子（CRP、IL-6 等）水平的升高、胰島素及胰島素樣生長因子分泌的減少等均可能影響骨代謝[5?7]。另外，年齡、性別、生活方式、體重、吸煙、營養狀態、環境和遺傳等均是重要的影響因素。目前，對于單個基因與2 型糖尿病伴骨質疏松癥的研究，國內外已有不少報道，但CTR 聯合VDR 基因多態性與2 型糖尿病伴骨質疏松癥的研究報道較少。

降鈣素（ealeitonin，CT）是甲狀腺濾泡旁細胞分泌的多肽激素[8]，它能增強腎臟排泄鈣的能力，抑制破骨細胞的骨再吸收作用[9]。CTR 位于破骨細胞膜，分子量為89 kD，包含490 個氨基酸，現已證明氨基端功能區的e2 區是降鈣素結合位點。CTR 基因位于染色體7q21.3 上，CTR 基因的多態性是其核苷酸序列1377 處的C 突變為T，導致相應的蛋白結構中第463 氨基酸脯氨酸（CCG）突變為亮氨酸（CTG），從而使CTR 基因產生CC（純脯氨酸）、TT（純亮氨酸）、TC（脯氨酸、亮氨酸雜交型）3 種基因型[10]。

維生素D 是一組脂溶性類固醇衍生物，可以調節免疫反應、促進胰島素合成及分泌、增加胰島素敏感性。微生素D 在人體內沒有生物活性，臨床上往往通過檢測循環中的25（OH）D3 來反映人體內維生素D 的水平。VDR 屬類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族，廣泛存在于30 多種組織中[11]。維生素D 受體基因位于12 號染色體長臂q12-14，長約75 kD，是甾體類受體家族中的一員，由9 個外顯子和8 個內含子組成。對于VDR基因多態性，目前主要研究包括Fok I（rs2228570）、Bsm I（rsl544410）、Apa I（rs7975232）、Taq I（rs731236）4 種，Fok I 位于編碼區，控制VDR 蛋白生成；Bsm I、Apa I、Taq I 位于基因3′端，可能與多聚腺苷酸復制及VDR mRNA 穩定性有關。本研究選取Bsm I 酶切位點。

本研究結果顯示：從無骨質疏松癥組-骨量減少組-骨質疏松癥組，身高、體重、BMI 逐漸下降；女性占比則增多，分別是15 例（24.6%），50 例（45%），50 例（76.9%）；男性吸煙占比也增大，分別是24 例（52.2%），32 例（52.5%），11 例（73.3%）；提示體重可能是2 型糖尿病患者骨質疏松的保護性因素，而女性2 型糖尿病患者更易患骨質疏松，吸煙可能是2 型糖尿病患者骨質疏松的危險因素。但進一步Logstic 回歸分析顯示：身高、體重、BMI、性別、吸煙均未進入回歸方程，尚不能說明體重、性別、吸煙是昆明地區T2DM伴骨質疏松的癥的獨立危險因素。

從無骨質疏松組-骨量減少組-骨質疏松癥組，年齡逐漸增加，進一步Logstic 回歸分析顯示：年齡可進入回歸方程，說明年齡是昆明地區T2DM伴骨質疏松癥的獨立危險因素。與國內曹國磊[12]的研究結果一致。隨年齡增長，人體骨量在變化，30～40 歲時骨量積累達峰值，以后逐漸下降。Jonsson 等[13]發現：70 歲女性髖部骨折幾率是女輕女性的5 倍。所以，應做好70 歲以上老年人骨質疏松的防治工作。

在2 型糖尿病患者中，無骨質疏松組，骨量減少組，骨質疏松組3 組比較，CTR-VDR 基因型組合后分布頻率無統計學差異。進一步按CTRVDR 分組發現：三種組合的基因型患者，不同部位骨密度比較也無統計學差異。孟德峰[14]對新疆漢族女性的研究也發現：在骨質疏松組患者中，CTR-VDR 復合基因型與各部位骨密度無關。

綜上所述，T2DM 伴骨質疏松癥的影響因素及候選基因較多，筆者的研究發現，年齡是T2DM 伴骨質疏松癥的獨立危險因素，但未發現CTR-VDR 復合基因型與昆明地區 T2DM 伴骨質疏松癥的遺傳易感性有關。有待進行更加深入、廣泛、大樣本、多地域、多種族、多個基因的聯合研究，以期為2 型糖尿病骨質疏松的防治工作提供更多的有用信息和依據。