lncRNA調控間充質干細胞向成骨細胞分化的研究進展

張瑞欣，董語迪，肖建輝△

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），又稱間充質基質細胞（mesenchymal stromal cells，MSCs），是一種多能性基質細胞，曾被命名為成骨干細胞，其在骨病損及骨再生修復方面具有廣闊的應用前景［1］。在非編碼RNA中，有一類由RNA聚合酶Ⅱ產生的，長度超過200 nt的長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA），被認為是基因組中的“轉錄噪音”。近年來發現lncRNA在參與染色質重構、DNA甲基化、組蛋白修飾及作為miRNA前體等方面發揮了極其重要的作用，并且受到越來越多的關注［2］。lncRNA在MSCs成骨分化中具有轉錄前、轉錄后和翻譯后水平調節的特殊作用。同時，lncRNA對骨代謝平衡有重要調控作用，可通過多種信號通路和轉錄因子影響MSCs成骨分化過程。本文就lncRNA調控MSCs成骨分化的最新研究進展綜述如下。

1 lncRNA激活相關信號通路調節成骨分化

1.1 MAPK信號通路 MAPK通路主要包括ERK通路、JNK通路以及p38 MAPK通路，其中p38 MAPK信號通路在調節MSCs成骨分化過程中發揮重要作用。Zhang等［3］利用成骨培養基誘導骨髓間充質干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨分化，同時分析了一種被稱為分化拮抗非蛋白編 碼RNA（differentiation antagonizing nonprotein coding RNA，DANCR）的lncRNA表達情況，結果顯示，在成骨培養基誘導BMSCs成骨分化后，DANCR在BMSCs中的表達水平下降，提示DANCR可能是BMSCs成骨分化過程中的重要調節因子，進一步敲減DANCR后觀察到成骨標志物COL1和Runx2的mRNA表達水平上調，而過表達DANCR導致磷酸化p38絲裂原活化（p-p38）蛋白表達水平下調，但ERK1/2、JNK蛋白表達水平無明顯變化；為了進一步揭示誘導BMSCs成骨分化過程中p38蛋白與DANCR的關系，使用p38特異性抑制劑SB203580處理轉染DANCR過表達載體（pcDNA3.1-DANCR）的BMSCs，發現過表達DANCR導致p38 MAPK信號通路失活，提示DANCR通過p38 MAPK信號通路調控BMSCs成骨分化。Zheng等［4］利用qPCR檢測發現骨質疏松大鼠的BMSCs中的轉移相關的肺腺癌轉錄本1（metastasis-associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）呈低水平表達，并證實敲減MALAT1可導致BMSCs中堿性磷酸酶（ALP）活性降低以及OCN、Runx2和COL1等成骨標志物表達水平下調，提示MALAT1可能是BMSCs成骨分化過程中的正調節因子；另外，敲減MALAT1可促進MAPK家族的ERK1/2和p38的蛋白表達水平升高，MALAT1與MAPK信號通路的關聯可能為骨形成調控機制提供新的思路。有研究報道，在誘導BMSCs成骨分化過程中ALP活性增加，p-p38蛋白表達水平上調，lncRNA小核仁RNA宿主基因1（small nucleolar RNA host gene 1，SNHG1）表達水平下調，而過表達SNHG1不僅可以逆轉上述作用，還能夠增強神經前體細胞表達下調基因4（neural precursor cellexpressed developmentally downregulated gene 4，Nedd4）與p-p38的相互作用，破壞p-p38的蛋白穩定性，并促進p-p38泛素化；另外沉默Nedd4不僅逆轉過表達SNHG1對p-p38蛋白水平的下調作用，還能增強ALP活性和提高Osterix蛋白表達水平，以上結果表明SNHG1可通過Nedd4介導p-p38泛素化負調控p38 MAPK信號通路，從而抑制BMSCs成骨分化［5］。綜上，MAPK信號通路在lncRNA調控MSCs成骨分化的過程中起著重要作用。

1.2 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt/β-catenin信號通路是經典的Wnt信號通路，在成骨細胞分化和骨形成過程中起重要作用，其中β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的核心，在骨骼修復的早期，β-catenin不利于骨骼修復，但在骨骼修復后期，β-catenin加快成骨細胞分化并促進其骨基質的形成，因此，在此階段增加β-catenin含量有利于骨骼修復［6］。

Shen等［7］探討了同源異型盒基因轉錄反義基因間RNA（HOX transcript antisense intergenic RNA，HOTAIR）能否通過調節Wnt/β-catenin信號通路參與BMSCs成骨分化，結果表明，敲減HOTAIR可增強ALP活性并上調成骨標志物Runx2的mRNA和蛋白表達水平，增加鈣結節形成，而過表達HOTAIR不僅逆轉上述作用，同時導致Wnt/β-catenin信號通路相關蛋白β-catenin、cyclin D和C-myc表達水平下調，并且Wnt信號通路拮抗劑DKK1能夠減弱敲減HOTAIR對BMSCs成骨分化的促進作用，表明HOTAIR抑制BMSCs成骨分化，其潛在機制可能與Wnt/β-catenin信號通路有關。由此可見，lncRNA可與Wnt/β-catenin信號通路相互作用，在MSCs成骨分化過程中起關鍵調節作用。

1.3 lncRNA-miRNA調控網絡 自內源競爭性RNA（competing endogenous RNA,ceRNA）假說提出以來，已被多項研究證實［8-10］。lncRNA可以競爭性地與miRNA結合，參與miRNA對其靶基因的影響，從而調控MSCs成骨分化過程。

在骨形態發生蛋白2（bone morphogenetic protein 2，BMP2）誘導BMSCs成骨分化過程中，過表達lncRNA LOC100506178可上調BMSCs中的Runx2、Osterix和ALP的mRNA表達水平，有助于BMP2誘導BMSCs成骨分化，進一步研究發現過表達mir-214-5p下調BMSCs中的Runx2、Osterix和ALP的mRNA表達水平，并通過與BMP2的3'UTR結合而抑制BMP2的表達，從而抑制BMSC成骨分化；同時研究證實LOC100506178可直接調控mir-214-5p的表達水平，LOC100506178通過抑制mir-214-5p表達從而增強BMP2誘導的BMSCs成骨分化［11］。Yu等［12］在誘導肌腱干細胞（tendon stem cells，TSCs）成骨分化過程中分析了鉀電壓門控通道亞家族Q成員1對側鏈1（potassium voltage-gated channel subfamily Q member 1 opposite strand 1，KCNQ1OT1）的表達情況，發現敲減KCNQ1OT1導致ALP活性以及Runx2和Osterix蛋白表達降低，提示KCNQ1OT1是TSCs成骨分化的正調節因子，另外通過生物信息軟件發現mir-138與KCNQ1OT1之間存在可能的結合位點，并通過RNA下拉實驗進一步證實了KCNQ1OT1與mir-138的相互作用關系，提示在TSCs成骨分化機制中可能涉及ceRNA機制。Shang等［13］使用糖皮質激素干預大鼠BMSCs 7 d后進行了lncRNA芯片分析，發現lncRNA TCONS_00041960表達水平下調，而過表達TCONS_00041960能夠上調Runx2和Osterix的mRNA和蛋白表達，提示TCONS_00041960有助于促進BMSCs成骨分化，進一步研究發現TCONS_00041960作為內源競爭性RNA可通過抑制mir-204-5p和mir-125a-3p表達，從而增強BMSCs中Runx2的表達，促進BMSCs成骨分化。Jia等［14］在誘導BMSCs成骨分化研究中，應用高通量RNA測序技術分析篩選出6個明顯上調的lncRNA，即lnc-1369、lnc-554、lnc-1269、lnc-1370、RP11-348J24.8和LINC00707，并發現過表達lncRNA LINC00707可促進BMSCs中Runx2和OCN的mRNA表達水平上調，增強ALP活性以及增加鈣結節形成，表明LINC00707促進BMSCs成骨分化，進一步研究發現LINC00707充當mir-370-3p的內源競爭性RNA，LINC00707通過抑制mir-370-3p表達以增強Runx2和OCN表達水平，從而促進BMSCs的成骨分化。牙周炎是一種發生在牙周組織的慢性感染性口腔疾病，牙槽骨吸收是其導致牙齒脫落的主要原因。Feng等［15］研究發現，在成骨培養基誘導牙周間充質干細胞（periodontal mesenchymal stem cells，PDLSCs）成骨分化過程中，ALP、Runx2和OCN的蛋白表達水平以及X失活特異轉錄本（X inactivate-specific transcript，XIST）表達上調，而mir-214-3p表達下調，進一步研究發現敲減XIST導致Runx2和OCN蛋白表達水平下調，表明XIST促進PDLSCs成骨分化，而過表達mir-214-3p顯著降低ALP、Runx2和OCN的蛋白表達水平，mir-214-3p不利于PDLSCs成骨分化；通過進一步研究發現，mir-214-3p是XIST的潛在靶標，XIST通過抑制mir-214-3p表達，增強ALP、Runx2和OCN的蛋白表達水平，從而促進PDLSCs成骨分化。基于以上lncRNA與miRNA相互作用調控PDLSCs成骨分化的結果，可以考慮將lncRNAmiRNA調控網絡聯合MSCs的機制應用于誘導牙槽骨再生、修復受損的牙周組織，探索新的治療方法。由此可見，lncRNA-miRNA相互作用關系在MSCs誘導成骨分化過程中起到重要的調節作用，同時對成骨相關疾病的臨床診療具有重要意義。

2 lncRNA介導相關轉錄因子調節MSCs成骨分化

2.1 CXC趨化因子配體13（CXC chemokine ligand 13，CXCL13）CXCL13已被證明能影響骨關節炎患者的成骨細胞增殖［16］。同時，趨化因子受體與配體相互作用可影響MSCs的遷移，如CXCL13可與CXC趨化因子受體5（CXC chemokine receptor 5，CXCR5）特異結合，調節MSCs的遷移和分化，并且CXCL13參與MSCs成骨分化，通過下調mir-23a而促進Runx2的表達，促進BMSCs成骨分化［16-18］。

研究發現高糖（high glucose，HG）可通過降低分離培養自4～5周齡雌性C57BL/6小鼠BMSCs中ALP活性以及Runx2、OCN和OPN的蛋白表達水平從而抑制BMSCs成骨分化，并呈時間依賴性降低AK028326和CXCL13的mRNA表達水平，而過表達AK028326能夠逆轉HG對BMSCs成骨分化的抑制作用，過表達CXCL 13能夠增強BMSCs的ALP活性；另外，在成骨細胞系MC3T3-E1細胞中，AK028326正向調節CXCL13表達，AK028326可通過上調CXCL13的表達促進BMSCs成骨分化過程［19］。因此，CXCL 13與lncRNA相互作用有助于調節BMSCs成骨分化過程，關注兩者相互作用可為骨形成調控機制以及治療骨相關疾病（如骨質疏松癥）提供新的思路。

2.2Zeste增強子同源復合物2（enhancer of Zeste homolog 2，EZH2）EZH2、Zeste基因抑制子基因12（suppressor of Zeste 12，SUZ12）和胚胎外胚層發育（embryonic ectoderm development，EED）3個核心亞基屬于多梳抑制復合物2（polycomb repressive complexes 2，PRC2）。有研究發現，EZH2是MSCs成骨分化的抑制調節因子，通過敲減EZH2可上調Runx2、OPN和OCN表達水平，促進MSCs成骨分化［20］。同時，ZBTB16（zinc finger and BTB domain containing 16）、抗 黏 液 病 毒 蛋 白（myxovirus resistance，MX1）和細胞骨架相關蛋白four and half LIM domain 1（FHL1）作為EZH2的新靶點，在調節MSCs成骨分化過程中也發揮重要作用［21］。

Zhu等［22］探討了lncRNA HoxA-AS3與EZH2相互作用對MSCs成骨分化的影響，發現敲減lncRNA HoxA-AS3可增強MSCs中ALP活性并上調成骨標志物Runx2、COL1A1、IBSP、BGLAP和SPP1的mRNA表達水平，進一步研究發現HoxA-AS3與EZH2相互作用可抑制關鍵成骨標志物Runx2的表達，從而抑制MSCs成骨分化。目前研究發現與EZH2相關的lncRNA包括KCNQ1OT1、GAS5、MEG3、HOTAIR和MALAT1［23］，但它們在調控MSCs成骨分化中的作用機制尚不明確。因此EZH2與lncRNA參與調控MSCs成骨分化的機制有待于深入研究。

2.3 核因子（NF）-κB NF-κB是一種可調控的轉錄因子，在免疫反應、炎癥反應和細胞分化中起核心作用［24］。NF-κB作為炎癥和宿主免疫反應的主要調節因子，在調節MSCs成骨細胞的分化以及骨骼形成方面同樣發揮著重要作用［25-26］。

Jin等［27］為了證實炎癥因子對人脂肪源性干細胞（human adipose-derived stem cells,hASCs）成骨分化的影響，在成骨培養基中添加外源性腫瘤壞死因子（TNF）-α/白細胞介素（IL）-17，結果發現，MIR31宿主基因（MIR31HG，也稱為LOC554202）的表達水平上調，并且ALP、Osterix和Runx2的mRNA表達水平以及p65磷酸化和總β-catenin蛋白表達水平降低，為了證實TNF-α/IL-17是否通過NF-κB和β-catenin途徑抑制hASCs成骨分化，分別使用BAY11-7082阻斷NF-κB的活化、氯化鋰（LiCl）阻斷β-catenin的降解，結果發現BAY11-7082和LiCl改善了TNF-α/IL-17對hASCs成骨分化的抑制作用，表明TNF-α/IL-17通過激活NF-κB和β-catenin途徑抑制hASCs成骨分化，進一步研究發現，敲減MIR31HG不僅逆轉TNF-α/IL-17對hASCs成骨分化的抑制作用，還導致NF-κB的靶基因IL-6、IL-7、IL-11和TNF-α表達下調以及NF-κB活性降低，另外激活的NF-κB可促進MIR31HG的表達上調，導致ALP、Runx2、Osterix和OCN的表達下調，從而抑制hASCs成骨分化，表明MIR31HG與NF-κB相互作用可調節骨形成。Zhang等［28］利用成骨培養基誘導經血間充質干細胞（menstrual blood-derived mesenchymal stem cells，MenSCs）和臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs）成骨分化，發現在MenSCs和UCMSCs中lncRNA NKILA表達水平上調，并且敲減NKILA導致MenSCs的鈣結節形成減少，ALP活性降低以及Runx2、Osterix和分泌型磷酸蛋白1（secerted phosphoprotein1，SPP1）的mRNA表達水平下調，表明NKILA正向調節MenSCs成骨分化，另外通過蛋白質印跡分析和芯片證實NKILA可抑制NF-κB的轉錄活性，進一步研究發現NF-κB抑制劑Bay11-7082處理MenSCs導致Runx2的表達上調，提示NKILA通過NF-κB介導Runx2表達，從而促進MenSCs成骨分化。由此可見，NF-κB可參與調控MSCs成骨分化，但目前NF-κB與lncRNA調節MSCs成骨分化的機制尚未明確，有待進一步研究。

2.4 BMP BMP屬于轉化生長因子-β（TGF-β）超家族成員，是體內外骨形成的多能性調節因子［29］，其中BMP2、BMP4和BMP9在MSCs成骨分化過程中均發揮重要作用。

Zhang等［30］發現在誘導BMSCs成骨分化過程中mir-140-5p表達呈時間依賴性下調，而lncRNA MSC反義RNA 1（MSC antisense RNA 1，MSC-AS1）和BMP2表達以及成骨標志物Runx2、OPN、OCN的mRNA表達水平呈時間依賴性上調，提示MSC-AS1可能對BMSCs成骨分化具有調節作用，進一步研究發現敲減MSC-AS1導致Runx2、OPN和OCN的mRNA表達水平下調，表明MSC-AS1促進BMSCs成骨分化，此外，MSC-AS1作為mir-140-5p的內源競爭性RNA，通過mir-140-5p調節BMP2/Smad信號通路從而促進BMSCs成骨分化。Gan等［31］利用BMP2誘導BMSCs成骨分化，發現mir-19b-3p表達上調和lncRNA H19表達下調，并且抑制mir-19b-3p導致BMSCs的細胞增殖水平和ALP活性降低，Runx2和COL1A1蛋白表達水平下調，表明mir-19b-3p是BMSCs成骨分化的正調節因子，進一步研究發現過表達H19導致mir-19b-3p表達水平下調，以及ALP活性降低和Runx2、COL1A1的蛋白表達水平下調，提示H19通過調節mir-19b-3p從而參與BMP2誘導的BMSCs成骨分化過程。目前，BMP2已經應用于骨病的臨床治療，美國食品和藥物管理局（FDA）批準在脊柱融合手術、脛骨干修復和上頜竇重建手術中可使用重組人BMP-2（rhBMP-2）［32］。BMP2和BMP4在MSCs成骨分化中均表現出成骨活性，并且BMP4作為骨形成的調節劑，在MSCs成骨分化中發揮作用。Zhuang等［33］在多發性骨髓瘤（multiple myeloma,MM）患者中分析了成骨培養基誘導MSCs成骨分化過程中lncRNA MEG3和BMP4表達情況發現，MM患者與正常供者相比，MM-MSCs中的MEG3和BMP4表達水平下降，并且MM-MSCs和正常供者MSCs中的BMP4與MEG3表達呈正相關，在BMP4誘導的MM-MSCs成骨分化過程中，MM-MSCs中Runx2、Osterix和OCN的mRNA表達水平上調，過表達MEG3影響BMP4啟動子上轉錄因子SOX2活性從而上調BMP4的轉錄水平，并上調Runx2、Osterix和OCN的mRNA表達，認為MEG3與BMP4相互作用能夠增強MM-MSCs的成骨分化。另外，除BMP2和BMP4外，BMP9也被認為是誘導MSCs成骨分化的有效因子之一。Zhang等［34］發現在BMP9誘導小鼠脂肪來源MSCs成骨分化早期lncRNA Rmst表達上調，并發現敲減Rmst導致BMP9誘導的小鼠脂肪來源MSCs的OPN、OCN和COL 1A1的mRNA表達顯著降低，ALP活性降低，體內骨形成數量減少，提示Rmst在BMP9誘導的小鼠脂肪來源MSCs成骨分化中起促進作用。

綜上所述，lncRNA通過相關信號分子調控包括BMSCs在內多種來源MSCs成骨分化，見表1。涉及諸多信號通路和轉錄因子，lncRNA在MSCs成骨分化中扮演著重要的角色。目前，lncRNA在MSCs成骨分化中作用的研究仍處于起步階段，對于lncRNA調節成骨分化的功能、生物學特性以及與信號通路的相互作用關系有待深入研究。例如：（1）環狀RNA（circRNA）和lncRNA相互作用可以促進干細胞的自我更新，而circRNA-lncRNA途徑參與調節MSCs成骨分化過程有待進一步探究。（2）目前還存在許多未知的靶點使各調節通路相互結合從而參與調控MSCs成骨分化過程。（3）隨著對lncRNA與MSCs關系研究的深入，lncRNA可否作為標志物為疾病的診斷提供依據尚未得到明確的證實。今后希望借助更多更有效的研究手段和新方法，充分揭示lncRNA調控MSCs成骨分化的作用靶點及機制，為骨質疏松癥等疾病的診治提供新思路、新策略。