原發(fā)免疫性血小板減少癥COX-1和COX-2水平與Th17、Treg細(xì)胞的相關(guān)性研究

徐培杰，江慧娟，姚建軍，蔡云峰，劉學(xué)武

（浙江衢化醫(yī)院，浙江 衢州 324000）

原發(fā)免疫性血小板減少癥（Primary immune thrombocytopenia，ITP）是由于自身免疫系統(tǒng)平衡失調(diào)引起的一種血液系統(tǒng)疾病，近年來(lái)發(fā)病率逐漸上升[1]。該病的發(fā)病機(jī)制尚不明，目前大量的研究證明免疫系統(tǒng)的失衡在ITP發(fā)生中起重要作用[2]，其中有關(guān)輔助性 T細(xì)胞（Th）Th17和調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞（Treg）的研究表明，ITP患者血漿中存在Th17/Treg失衡，兩者相互抑制，與免疫疾病的發(fā)生密切相關(guān)[3]。另外，有研究提出，環(huán)氧化酶-1（COX-1）、環(huán)氧化酶-2（COX-2）與血小板的聚集有關(guān)，在ITP發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[4]。本研究旨在探討ITP患者血清COX-1與COX-2水平與Th17/Treg的相關(guān)性，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 以2017年9月-2019年3月本院收治的原發(fā)免疫性血小板減少癥（ITP）40例作為ITP組，另隨機(jī)抽取同期本院體檢健康者28例作為對(duì)照組。ITP組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《成人原發(fā)免疫性血小板減少癥診斷與治療中國(guó)專(zhuān)家共識(shí)（2016年版）》的ITP診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]；（2）未接受過(guò)免疫治療、血小板輸入和脾切除治療；（3）未服用影響凝血功能的藥物；（4）自愿參與本試驗(yàn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他免疫性疾病；（2）有肝功能障礙、精神障礙、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤等重大疾病之一者。兩組一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），詳見(jiàn)表1。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審查通過(guò)，且患者知情同意。

表1 兩組一般資料比較（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）

組別 n 男/女 年齡（歲）ITP 組 40 28/12 42.3±0.8對(duì)照組 28 18/10 42.4±0.4

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 CD3-Percp、CD4-APC、CD25-PE抗體由美國(guó)BD公司提供；Foxp3-FITC、FITCIL7A、COX-1及COX-2檢測(cè)試劑盒由美國(guó)eBioscience公司提供；Fix-Perm medium A/B固定/破膜工作液由上海玉博生物科技有限公司提供；佛波醇乙酯PMA、離子霉素試劑由美國(guó)默克Sigma公司提供；Epics-xl流式細(xì)胞儀由美國(guó)GE公司提供。

1.2.2 指標(biāo)檢測(cè) （1）Treg檢測(cè)：空腹采集靜脈血6mL，用密度梯度離心法獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs）。取 16外周血單個(gè)核細(xì)胞加入 CD3-Percp、CD4-APC 和 CD25-PE 各 20，4℃下染色 30分鐘，用PBS液沖洗2遍，加入Foxp3 Fix/Perm液1mL，在4℃下孵育30分鐘，棄去上清液后用Foxp3破膜緩沖液清洗，再加入Foxp3-FITC抗體20在4℃下染色30分鐘，用PBS液沖洗2遍后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。（2）Th17檢測(cè)：取（1）中的外周血單個(gè)核細(xì)胞 1106，加入佛波醇乙酯、離子霉素（1mg/L）37℃下孵育5小時(shí)，PBS液沖洗2遍后加入CD3-Percp、CD4-APC各20，4℃下染色 3分鐘， 用 PBS液沖洗2遍，加入Fix-Perm medium A液固定15分鐘，加入Fix-Perm medium B液和FITC-IL7A染色20分鐘，用PBS液沖洗2遍后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。（3）COX-1和COX-2檢測(cè)：采用ELISA法檢測(cè)所有實(shí)驗(yàn)對(duì)象的血清COX-1和COX-2水平，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.3 觀察指標(biāo) 比較兩組COX-1、COX-2水平及Th17/Treg；分析ITP患者血清COX-1、COX-2水平與 Th17、Treg、Th17/Treg 的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，并用Pearson進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 Th17/Treg ITP組外周血中Th17占比以及Th17/Treg高于對(duì)照組，而Treg細(xì)胞水平占比低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表2。

表2 兩組外周血Th17、Treg細(xì)胞比較（±s）

表2 兩組外周血Th17、Treg細(xì)胞比較（±s）

與對(duì)照組比較*P＜0.05

組別 n Th17（%） Treg（%） Th17/Treg ITP 組 40 3.17±0.23* 3.12±0.12* 2.71±0.24*對(duì)照組 28 1.23±0.14 7.46±0.21 0.93±0.08

2.2 COX-1、COX-2水平 ITP組 COX-1、COX-2水平均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。詳見(jiàn)表 3。

表3 兩組 COX-1、COX-2 水平比較（±s，ng/L）

表3 兩組 COX-1、COX-2 水平比較（±s，ng/L）

與對(duì)照組比較*P＜0.05

組別 n COX-1 COX-2 ITP 組 40 15.31±0.72* 17.42±0.56*對(duì)照組 28 8.84±0.38 10.26±0.59

2.3 COX-1、COX-2與 Th17、Treg的相關(guān)性 ITP患者血清中COX-1、COX-2水平與Th17細(xì)胞數(shù)呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與Th17/Treg呈正相關(guān)（P＜0.05）。 詳見(jiàn)表 4。

表4 ITP患者血清 COX-1、COX-2水平與Th17、Treg、Th17/Treg的相關(guān)性

3 討論

ITP主要由機(jī)體的免疫功能異常引起血小板減少所致，病情嚴(yán)重時(shí)可危及患者生命。研究顯示，機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂會(huì)導(dǎo)致血小板與血小板抗體結(jié)合，從而破壞機(jī)體內(nèi)皮系統(tǒng)，導(dǎo)致血小板數(shù)量減少[6]，而COX-1能夠?qū)ρ“宓木奂a(chǎn)生抑制，機(jī)體內(nèi)COX-1和COX-2的異常表達(dá)在ITP患者的發(fā)病機(jī)制中起重要作用[7]。另外，大量研究顯示，T細(xì)胞亞群比例不平衡也會(huì)導(dǎo)致ITP的發(fā)生[8]，本研究主要探討ITP患者血清COX-1、COX-2水平與Th17、Treg細(xì)胞的關(guān)系，以便為COX-1與COX-2對(duì)ITP的早期診斷和治療提供一定的理論依據(jù)。

環(huán)氧化酶是一種限速酶，能夠促進(jìn)花生四烯酸對(duì)前列腺類(lèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化過(guò)程，目前對(duì)COX的研究主要集中在腫瘤方面。有研究證明，COX的兩種異構(gòu)體在惡性腫瘤患者體內(nèi)均顯著升高[9]，且COX-1水平隨疾病的嚴(yán)重程度而升高，而COX-2可通過(guò)對(duì)過(guò)氧化酶增殖物激活受體的抑制表達(dá)造成T細(xì)胞亞群的混亂。現(xiàn)有研究顯示，T細(xì)胞亞群的紊亂參與了ITP的發(fā)病過(guò)程，其中Treg作為一種具有獨(dú)特免疫反應(yīng)的T細(xì)胞，主要發(fā)揮降低機(jī)體對(duì)抗原的免疫反應(yīng)來(lái)提高自身耐藥性的作用，它的兩大特征分別是免疫抑制及免疫應(yīng)答。ITP患者體內(nèi)出現(xiàn)Treg細(xì)胞數(shù)量下降、免疫功能減弱的現(xiàn)象，但通過(guò)藥物的治療后能恢復(fù)正常。Th17細(xì)胞屬于T細(xì)胞的一種亞群，能夠通過(guò)釋放炎性因子和聚集中性粒細(xì)胞起自身免疫的作用。有研究顯示，ITP患者體內(nèi)Th17細(xì)胞量增加且更活躍，抑制了Treg細(xì)胞的活性，導(dǎo)致Th17/Treg失衡從而促進(jìn)ITP的發(fā)生發(fā)展，這一過(guò)程可能是通過(guò)增強(qiáng)B細(xì)胞的反應(yīng)、增加抗血小板抗體的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10]。

Th17細(xì)胞主要通過(guò)分泌特異性IL-17刺激多種細(xì)胞參與機(jī)體免疫防御；Treg可通過(guò)分泌TGF-β、IL-10等細(xì)胞因子發(fā)揮免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)的作用。本研究顯示，ITP患者體內(nèi)血清環(huán)氧化酶COX水平比對(duì)照組高，同時(shí)，ITP患者外周血Th17細(xì)胞的數(shù)量顯著升高，Treg細(xì)胞數(shù)量顯著降低，導(dǎo)致Th17/Treg顯著升高，與健康人群相比，ITP患者的Th17/Treg處于失衡狀態(tài)，這種失衡可能參與了ITP疾病的發(fā)生，與相關(guān)研究結(jié)論一致[11]。本研究又將ITP患者血清COX-1、COX-2與Th17/Treg進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，COX-1與Th17細(xì)胞數(shù)、Th17/Treg細(xì)胞比例呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)；COX-2與 Th17細(xì)胞數(shù)、Th17/Treg呈正相關(guān)，與Treg細(xì)胞數(shù)呈負(fù)相關(guān)。說(shuō)明隨著ITP患者體內(nèi)Th17/Treg細(xì)胞比例逐漸失衡，免疫系統(tǒng)紊亂，COX-1與COX-2在患者血清中的水平也逐漸升高，作者認(rèn)為兩者可能共同參與ITP的發(fā)病過(guò)程，相關(guān)機(jī)制可能是機(jī)體通過(guò)升高Th17/Treg，引起患者免疫系統(tǒng)的失衡所致。

綜上，ITP患者血清COX-1、COX-2水平顯著升高，且Th17/Treg升高，COX-1、COX-2與 Th17/Treg均呈正相關(guān)，兩者可能共同參與ITP的發(fā)病，臨床可通過(guò)檢測(cè)COX-1與COX-2的水平對(duì)ITP患者體內(nèi)免疫狀態(tài)進(jìn)行及早判斷，有助于早期診斷或干預(yù)。