高危型HPV感染共刺激分子B7-H1的表達及其與宮頸上皮內瘤變的相關性

王珍，應慧群，舒媚

（永康市中醫院，浙江 永康 321300）

目前已知的人乳頭狀病毒（Human papillary virus，HPV）有200多種，其中40多種與生殖道感染相關[1]。高危型HPV16是常見感染的高危型人乳頭狀病毒，且在多數宮頸上皮瘤變和宮頸癌患者中均可檢測到[2]，故高危型HPV16宮頸上皮瘤變可能有關。B7免疫球蛋白超家族成員-1（Member of B7 immunoglobulin superfamily-1，B7-H1）等共刺激分子是T細胞或B細胞完全活化后提供共刺激信號的細胞表面物質，又稱“程序性死亡配體-1”，與上皮細胞異常表達的免疫調節有關，與受體結合可促使T淋病細胞凋亡導致腫瘤細胞逃避細胞毒性T淋巴細胞的攻擊，與宮頸癌密切相關[3-4]。因此，高危型HPV16感染共刺激分子B7-H1的表達情況也可能與宮頸上皮內瘤變相關，但目前缺乏相關研究。本文探討高危型HPV16感染共刺激分子B7-H1的表達情況，并分析高危型HPV16感染、B7-H1表達情況與宮頸上皮內瘤變級別的相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性選擇2018年1月-2020年6月本院高危型HPV陽性患者160例。納入標準：經宮頸表面、陰道穹隆分泌物PCR核酸檢測確定為高危型HPV陽性的非妊娠女性，年齡15-65歲，既往宮頸篩查結果正常。排除標準：混合感染、既往有宮頸手術史、有脾切除或淋巴切除等可能損害機體免疫功能的手術史、有惡性腫瘤史、合并自身免疫疾病或正在進行免疫抑制治療者。160例中絕經112例，未絕經48例；有分娩史143例，無分娩史17 例，年齡 42-63 歲，平均（55.8±5.5）歲，其中年齡＜50歲以下36例。研究經本院倫理學委員會審批通過且患者知情同意。

1.2 方法 （1）囑患者在檢查前3天內禁性生活、陰道內用藥或盆浴，行陰道鏡檢查，采用10mL一次性無菌注射器取5mL生理鹽水，沖洗陰道后穹窿和宮頸，回吸于無菌離心管內，收集患者陰道灌洗液，在2000rpm、3cm半徑、4℃中離心處理10分鐘，分層后取上清液用于相關指標檢測。（2）采用qRT-PCR法檢測不同HPV型感染患者陰道灌洗液B7-H1 mRNA表達水平的差異，取待檢測樣本，常規提取總RNA，逆轉錄形成cDNA。進行qRTPCR擴增反應：95℃預變性1分鐘、94℃變性0.5分鐘、58℃退火0.5分鐘，72℃延伸1分鐘，共35個循環后，72℃延伸10分鐘，PCR產物常規進行瓊脂凝膠電泳，采用 2-△△Ct法進行 B7-H1 的定量分析。（3）采用Western blot法檢測不同HPV型別感染者陰道灌洗液B7-H1蛋白表達水平。取待檢測樣本行冰上裂解、蛋白質定量分析，分裝并添加緩沖液，在熱處理使蛋白變性、電泳后行PVDF膜轉膜，行1小時的封閉處理后加入B7-H1稀釋抗體孵育過夜，添加稀釋二抗，以β-actin為內參，掃描灰度值，并計算B7-H1蛋白相對含量。（4）常規行陰道鏡病理檢查分析HPV16感染宮頸病變程度[5]，檢查結果分為無病變、低級別鱗狀上皮內病變（LSIL，輕度不典型增生）、高級別鱗狀上皮內病變（HSIL，中重度不典型增生）、宮頸癌。

1.3 統計學處理 采用SPSS21.0軟件進行數據處理。計量資料均符合正態分布，以（±s）表示，多組之間采用方差分析，并通過SNK-q檢驗進一步兩兩比較；計數資料用百分率表示，采用χ2檢驗；采用Spearman相關法分析B7-H1 mRNA相對表達量、蛋白表達水平與宮頸上皮內瘤變級別的關系。

2 結果

2.1 高危型HPV感染情況 160例共檢出HPV16感染 65例（40.63%）、HPV18感染（21.88%）、HPV52感染（15.00%）、HPV56感染（12.50%）、HPV58感染（10.00%）。

2.2 HPV16感染的宮頸上皮內瘤變級別 HPV16感染的 65例中無病變者 20例（30.77%）、LSIL22例（33.85%）、HSIL15 例（23.08%）、宮頸癌 8 例（12.31%）。

2.3 不同高危型HPV的B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平 高危型HPV16感染者陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平均高于其他高危型HPV感染者（P＜0.05）；高危型HPV18、HPV52、HPV56、HPV58 感染者陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平比較差異均無統計學意義（P＞0.05）。 詳見圖 1、表 1。

表1 不同高危型HPV感染者的B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平比較（±s）

表1 不同高危型HPV感染者的B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平比較（±s）

*注：B7-H1蛋白表達=B7-H1灰度值/β-actin灰度值與 HPV16 比較△P＜0.05

高危型 HPV n B7-H1 mRNA（2-△△Ct） B7-H1 蛋白表達 *HPV16 65 0.98±0.18 0.95±0.15 HPV18 35 0.24±0.12* 0.21±0.12△HPV52 24 0.22±0.14* 0.18±0.08△HPV56 20 0.29±0.11* 0.25±0.16△HPV58 16 0.31±0.17* 0.27±0.14△F值 — 213.582 279.559 P—＜0.01 ＜0.01

圖1 不同高危型HPV感染者B7-H1蛋白表達水平的Western blot檢測結果

2.4 高危型HPV16不同宮頸上皮內瘤變級別的陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平比較 隨著高危型HPV16感染患者宮頸上皮內瘤變級別的升高，其陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平均升高（P＜0.05），詳見表2。Spearman相關分析結果顯示，HPV16感染者陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平與其宮頸上皮內瘤級別均呈正相關（rB7-H1mRNA相對表達量=0.878，rB7-H1mRNA蛋白表達水平=0.825，P＜0.05）。

表2 高危型HPV16不同宮頸上皮內瘤變級別的陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平比較（±s）

表2 高危型HPV16不同宮頸上皮內瘤變級別的陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平比較（±s）

注：B7-H1蛋白表達=B7-H1灰度值/β-actin灰度值與無病變比較 *P＜0.05；與 LSIL比較 #P＜0.05；與 HSIL比較△P＜0.05

宮頸上皮內瘤變級別 n B7-H1 mRNA（2-△△Ct） B7-H1蛋白無病變 20 1.06±0.24 0.99±0.21 LSIL 22 0.90±0.19* 0.88±0.12*HSIL 15 0.81±0.20*# 0.79±0.17*#宮頸癌 8 0.72±0.16*#△ 0.68±0.15*#△F值 - 6.983 8.060 P-＜0.01 ＜0.01

3 討論

HPV為環狀雙鏈DNA病毒，核心為7800-7900個堿基通過共價鍵形式組成具有遺傳信息的閉合環狀雙鏈DNA，可引起人體的皮膚以及黏膜的鱗狀上皮增生，其中超過40種HPV與生殖道感染密切相關，根據其生物學特征以及致癌的潛在可能性，可分為高危型和低危型，其中高危型HPV的E6和E7基因編碼的原癌蛋白是導致宮頸癌發生的重要因子[6-8]。因此，高危型HPV感染及其致癌機制的相關研究對于宮頸癌預防和癌前干預具有重要的指導意義。研究中多數宮頸上皮瘤變和宮頸癌患者均可見高危型HPV16、HPV18等感染[9-11]。本研究顯示，高危型HPV陽性160例中HPV16感染最多見，共65例（占40.63%），臨床需重視。本研究對HPV16感染者的宮頸上皮內瘤變級別進行分析，結果發現65例HPV16感染者中僅20例（30.77%）無宮頸上皮內瘤變，其余患者均存在不同程度的宮頸上皮內瘤變，提示HPV16感染可促進宮頸癌的發生發展，高危型HPV16感染的相關研究對宮頸癌的防治具有重要意義。

宮頸癌發生發展與多種機制相關，其中免疫調節發揮了重要作用[12-13]。B7-H1是與腫瘤免疫調節密切相關因子，為B7家族成員，在與受體結合之后可誘發抑制性信號，從而誘導T細胞的凋亡以及抑制T細胞的活化和增殖，從而參與腫瘤免疫調節過程[14-16]。在正常組織細胞中，B7-H1的作用為下調效應性Y細胞功能、阻止T細胞對組織細胞過度反應導致的自身免疫學疾病；而在腫瘤細胞中，B7-H1的作用為誘導腫瘤抗原特異性T細胞凋亡，促進腫瘤免疫逃逸，從而促進腫瘤的發生發展和浸潤轉移[17-19]。因此，B7-H1亦可能參與宮頸癌的發生發展乃至轉移。

李巧稚等[20]研究證實，高危型HPV16感染可促使B7-H1在子宮頸病變中表達且B7-H1的表達與宮頸病變的病情相關，B7-H1可能為高危型HPV16感染促進宮頸病變乃至癌變的重要因素，但這一關系尚不明確。本研究比較了不同高危型HPV感染者陰道灌洗液B7-H1的表達水平，結果顯示，與其他高危型HPV比較，高危型HPV16者的陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平更高，證實“高危型HPV16感染促進了B7-H1表達”的結論，與李巧稚等[20]的研究結論一致。HPV16感染后HPV E6、E7可與p53、Rb協同作用導致癌癥發生，在HPV16感染初期即可上調B7-H1表達而促進腫瘤細胞逃避機體免疫監視，從而促進HPV16持續感染，并為腫瘤發生發展創造條件。本研究中，高危型HPV16感染患者隨著宮頸上皮內瘤變級別的升高，其陰道灌洗液B7-H1 mRNA的相對表達量和蛋白表達水平也升高，Spearman相關分析證實了HPV16感染者陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達量和蛋白表達水平與其宮頸病變程度均呈正相關。

綜上所述，B7-H1與高危型HPV16感染及宮頸病變均密切相關，可能成為高危型HPV16感染宮頸癌前病變預防性干預的靶點。