HBsAg與HBsAb雙陽性慢性乙肝患者Pre-S/S區基因突變研究

王海堅，林建萍，鄭霜，邵偉，李超，童郁，戴顯寧

（溫州市人民醫院，浙江 溫州 325000）

每年約有65萬人死于乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染所致的終末期肝臟疾病[1]。目前己發現的 HBV 有 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J 10 種基因型，中國以B和C基因型常見[2]，HBV基因型與疾病進展、治療和預后密切相關[3]。

通常情況下，乙肝表面抗體（Hepatitis B surface antibody，HBsAb）會在機體清除乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen，HBsAg）6 周-6 個月出現，是機體對抗HBV產生免疫力的標志。在臨床實踐中偶爾會遇到HBsAb和HBsAg雙陽性，國內外學者對其發生機制與臨床意義仍有爭論[4]。HBV“a”決定簇內的堿基突變已被證實可顯著改變HBsAg結構和抗原性[5]，從而影響HBsAb與HBsAg的結合，由野生型刺激產生的抗體對變異的HBsAg結合能力削弱，HBsAb無法完全中和體內存在的HBsAg，從而產生變異的HBsAg和野生的HBsAb兩者共存的現象[6]。本文通過對HBsAg與HBsAb雙陽性樣本的Pre-S1、Pre-S2及S區進行測序，探索出現HBsAg與HBsAb雙陽性的血清型模式與HBV S區與Pre-S1/S2基因突變的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2018年3月-2020年3月HBsAg/HBsAb雙陽性慢性乙肝患者64例（雙陽組），其中男 38 例，女 26 例，平均（40.6±12.4）歲，選擇同期HBsAg+/HBsAb-的慢性乙肝患者72例（對照組），其中男 42 例，女 30 例，平均（38.5±9.9）歲。兩組均符合《慢性乙型肝炎防治指南》診斷標準[7]，且無合并甲、丙、丁、戊型病毒性肝炎，并排除由其他原因引起的肝病，如藥物性肝病、自身免疫性肝病、酒精性肝炎等。本研究經本院倫理委員會審核通過且患者知情同意。

1.2 方法 HBV-DNA采用熒光定量PCR（陜西天隆試劑，最低檢測線30-100拷貝）檢測；乙肝病毒Pre-S/S區擴增使用引物及測序均由杭州擎科梓熙生物技術有限公司提供，通過巢氏PCR進行擴增。 （1）Pre-S1/S2 區引物： 第一輪：Pre-S1 F2814：GGGTCACCATATTCTTGGG，Pre-S1 R1006：GACCCACAATTCTTTGACAT；擴增條件：95℃ 3分鐘，95℃ 15 秒、53℃ 30 秒、72℃ 1 分鐘 30 個循環，72℃10 分鐘。 第二輪：Pre-S2 F2825：TTCTTGGGAACAAGAGCTAC； Pre-S2 R273： TTGAGAGAAGTCCACCACGA。擴增條件：95℃3分鐘，95℃15秒、54℃30秒、72℃1分鐘 30個循環，72℃10分鐘。 （2）S區引物：第一輪：Pre-S1F2818：CACCATATTCTTGGGAACAAG；Pre-S1R1428：GTAAACAAAGGACGTCCCGC；擴增條件：95℃ 3 分鐘、95℃ 30 秒、55℃ 30 秒、72℃ 2分鐘30個循環，72℃10分鐘。第二輪：Pre-S2 F56：CCTGCTGGTGGCTCCAGTTC； Pre-S2 R1113：CTTG TAAGTTGGCGAGAAAGT。擴增條件：95℃3分鐘、95℃ 30 秒、58℃30 秒、72℃1 分鐘 30 個循環，72℃10分鐘。

1.3 評價標準 通過對HBsAg與HBsAb雙陽性樣本的 Pre-S1、Pre-S2及 S區進行測序，通過（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi）進行HBV分型，確認感染基因型。使用SnapGene4.3.6觀察峰形圖，與對應基因型的參考序列（B 基因型：AF100309.1、D00329.1、KC774377.1、AB602818.1；C 基 因 型 ：AB033556.1、AB014381.1、X04615.1、AF533983.1）進行比對分析，探討出現HBsAg與HBsAb雙陽性的血清型模式與HBV S區、Pre-S1/S2基因突變的關聯。

1.4 統計學處理 采用SPSS 22.0軟件進行數據處理。計量資料用（±s）表示，正態分布的數據兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，非正態分布的資料采用Wilcoxon秩和檢驗；計數資料用百分率標志，并采用χ2檢驗。

2 結果

2.1 血清亞型比較 雙陽組、對照組B基因型的乙型肝炎病毒血清亞型均以adw2亞型為主，C基因型均以adrq+為主。兩組血清亞型差異無統計學意義（χ2=0.068、χ2=1.929，P＞0.05）。詳見表 1。

表1 兩組血清亞型比較（n）

2.2 S區、Pre-S1區、Pre-S2區突變率比較 （1）圖1可知，雙陽組S區中最易發生氨基酸突變的位點為T47、I126、T131，與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01），兩組 V14、F41、A45、S58、F161、M133、V224 位點差異有統計學意義（P＜0.05）。 （2）HBsAg與HBsAb共存可能與 S區 N端（aa1-99）、C端（aa170-226）、“a”決定簇第一環（aa124-137）堿基突變相關（P＜0.05 或 P＜0.01）（表 2），且發現雙陽組有7例標本發生無義突變，突變率為10.9%（χ2=6.213，P＜0.05）。Pre-S1 區、Pre-S2 區氨基酸突變差異無統計學意義（P＞0.05），但雙陽組6例堿基大片段缺失，突變率 10.3%（χ2=5.104，P＜0.05），而對照組均無此類現象發生。雙陽組的雜合突變率54.4%（35/64）也顯著高于對照組的 27.8%（20/72），差異有統計學意義（χ2=10.186，P＜0.01）。 （3）對比相同基因型雙陽組與對照組氨基酸序列后發現，兩組B基因型氨基酸突變率差異無統計學意義（P＞0.05）（表 2），兩組 C 基因型在 N 端、“a”決定簇第一環、C端差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表3。

表2 兩組S區、Pre-S1、Pre-S2突變率比較

表3 相同基因型S基因、Pre-S1基因、Pre-S2基因氨基酸殘基突變率比較

圖1 S 區氨基酸突變率分布圖（*P＜0.05，**P＜0.01）

3 討論

乙型肝炎病毒感染是一個威脅人類健康的全球性公共衛生問題，由于其“易突變”的特性，導致國內外學者對于乙肝病毒突變分析越來越重視。

本研究發現，雙陽組和對照組B基因型和C型基因差異無統計學意義（χ2=3.491，P＞0.05），未發現A、D、E等其他基因型的存在。有報道表明，C基因型比B基因型更容易出現肝臟疾病的發展和惡化，意味著HBV感染后HBsAg與HBsAb雙陽性現象的出現使進展為終末期肝病的風險提高[8]。

表2 提示，雙陽組的 S 區 N 端（aa1-99）、“a”決定簇的第一環（aa124-137）、C 端（aa170-226）均具有更高的突變率。據報道，S區基因的突變尤其是“a”決定簇的突變導致HBsAg抗原性發生改變，產生HBsAg與HBsAb共存的現象[9]，但進行基因型分組對比后卻發現，在B基因型中，雙陽組與對照組無論是在S區、Pre-S1、Pre-S2區差異均無統計學意義，而C基因型在N端、“a”決定簇第一環、C端、Pre-S2區差異有統計學意義。Lin等[10]研究表明，HBsAg和HBsAb雙陽性組較單純HBsAg陽性組有更高的“a”決定簇內點突變率，且C基因型具有更高的“a”決定簇突變率，B基因型差異無統計學意義，這都與本研究結論相似。此外，免疫應答細胞和抗體通過定位這個區域識別HBsAg，從而對所有HBV產生抵抗力，這也是目前研究的熱點，其中雙陽組每100個氨基酸殘基突變率最高的便是“a”決定簇第一環（aa124-137），高達 5.36（χ2=23.79，P＜0.01），而對照組各區每100個氨基酸殘基突變率普遍在0-2之間，但“a”決定簇第二環反而無顯著區別。 因此，可能“a”決定簇第一環（aa124-137）在維持HBsAg的穩定性、空間構象及免疫原性扮演著更重要的角色。

Zhu等[11]也同樣從HBsAg與HBsAb雙陽性標本中也發現了大片段缺失的現象。本實驗中，雙陽組內發現6例Pre-S區大片段缺失。Pre-S區由于含有與免疫應答有關的T細胞、B細胞的抗原決定簇，缺失可能使宿主發生免疫逃避，且HBV包膜蛋白與病毒顆粒在肝細胞內質網滯留，形成GGH（毛玻璃樣肝細胞）[12]，引起內質網發生應激反應，產生大量的活性氧自由基，造成DNA損傷，導致基因組不穩定，最終發生肝細胞癌變，因此，Pre-S區發生大片段缺失可能是原發性肝細胞癌發生的獨立危險因素[13]。且雙陽組內發現7例S區發生無義突變，在國內鮮有報道。無義突變導致蛋白翻譯提前終止，且由于S區參與構成主蛋白（HBsAg）、表面抗原中蛋白、表面抗原大蛋白，這將導致構成HBV外膜的免疫原性與空間構象等產生較大改變，造成HBsAb無法完全中和HBsAg而產生雙陽性現象。

雙陽組的Pre-S/S區雜合突變率54.4%（35/64）顯著高于對照組27.8%（20/72），測序中檢測到雜合突變峰可能是由于體內存在不同的病毒優勢株導致，人群中的HBV感染大多無法根治，少量變異株經過長年累月的復制，成為感染的優勢株。雖然測序方法對于突變株的檢出相對不敏感，只能檢出含量達10%的突變株，但實驗所得的數據差異仍有統計學意義（χ2=5.104，P＜0.05），說明 HBsAg 和HBsAb雙陽性的出現可能與體內存在豐富的病毒準種構成有關。

綜上所述，乙肝病毒Pre-S區的“a”決定簇第一環、C端、N端發生氨基酸突變可能與HBsAg和HBsAb雙陽性發生有關，且C基因型的突變率較B基因型高，可能與C基因型患者更易發生終末期肝病有關。同時，本文雙陽組內發現有S區無義突變、Pre-S區大片段堿基缺失、病毒準種構成豐富的現象，符合當代學者對于產生HBsAg和HBsAb雙陽性機制的猜想，但目前缺乏數據證實，因此，HBsAg和HBsAb雙陽性現象更可能由多種原因共同驅動所致。