Gremlin促血管生成作用的研究進展

謝宇欣 綜述 石國慶 審校

遵義醫科大學附屬醫院，貴州 遵義563000

血管生成是由組織中既存的成熟血管的內皮細胞發生增殖和游走，形成小的血管，包括一系列步驟：(1)原有血管基底膜降解并引起毛細血管芽的形成和細胞遷移；(2)內皮細胞向刺激方向遷移；(3)位于遷移細胞后面的內皮細胞增殖和發育成熟。所有這些步驟均由生長因子、細胞和細胞外基質間的相互作用所調控。血管生成在各種生理和病理條件下起著關鍵作用，如損傷修復、炎癥、腫瘤生長等。血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)在血管形成中發揮特殊作用。在發育成熟組織的生理性血管新生(如子宮內膜增殖)和病理性血管新生(如慢性炎癥、創傷愈合、腫瘤、視網膜病變、早熟等)過程中，VEGF作用最為重要。VEGF受體包括VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3，三者均屬于酪氨酸激酶受體。VEGF-VEGFR是血管生成的經典途徑信號通路。而近年來的研究發現Gremlin是一種新型的VEGFR2激動劑，因此，Gremlin作為一種新型促血管生成因子，Gremlin-VEGFR2是血管生成的非經典途徑信號通路。本文就Gremlin通過VEGFR2途徑促血管生成作用的研究進展做一綜述。

1 Gremlin的結構與功能

1.1 骨形態形成蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)拮抗劑Gremlin基因在物種間高度保守，屬于胱氨酸結超家族，其編碼3種蛋白質，分別為Gremlin-1、Gremlin-2、Gremlin-3。Gremlin-1是一種由骨髓間充質干細胞分泌的BMP拮抗劑，通過抑制BMP/Smad信號通路，調節胚胎發育過程中器官體征的形成以及骨骼發育，也可抑制腫瘤干細胞分化。有研究發現BMP-Gremlin信號通路在腎臟和尿路的胚胎發育、成骨細胞分化、腎功能和纖維化疾病進展中起了重要作用[1]，比如后腎間充質中需要大量的BMP-4抑制劑Gremlin-1來促進輸尿管芽的生長和上皮分支的形態發生[2]。此外，Gremlin-1還被證明可以通過激活典型的TGFβ信號加重由高濃度葡萄糖引起的足細胞損傷，這表明Gremlin可能在腎臟疾病的發生或發展中起作用[3]；人類Gremlin-2基因在胚胎發育過程中,通過激活JNK信號通路，促進胚胎干細胞向心房分化以及調節心房正常節律[4]。目前對Gremlin-3的機制研究尚不清楚。

1.2 血管內皮生長因子受體2(Vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)激動劑 在血管生成實驗中，發現加入純化的BMP拮抗劑Gremlin可誘導內皮細胞發芽、遷移和侵襲[5]。因此，Gremlin是一種新型血管內皮生長因子受體2(VEGFR2)激動劑，也是一種促血管生成因子，作為VEGFR2的活化配體發揮血管生成作用，促進內皮細胞增殖和血管形成[6]，它是目前已知的唯一能高親和力結合并激活VEGFR2，從而促進血管生成的CAN[7]。Gremlin既可作為單體存在，又可作為同型二聚體存在。單體Gremlinc141a是一種新型的VEGFR2拮抗劑，并結合VEGFR2導致與受體的非生產性相互作用，由于缺乏誘導受體二聚和內化的能力，所以單體Gremlinc141a缺乏促血管生成活性[8]。鑒于VEGFR2二聚并在與VEGF結合時激活，很容易推測Gremlin作為同型二聚體時，可以發揮血管生成功能[9-10]。Gremlin結合VEGFR2，誘導VEGFR2自磷酸化，激活PI3K/Akt-mTOR和Ekr-MAPK信號通路，促進血管增殖[7]，這種作用可能是通過Gremlin與內皮細胞表面硫酸肝素蛋白多糖的相互作用來實現的[11]。此外，αvβ3-整合素和αvβ3-整合素-VEGFR2復合物的形成也被證明參與了Grem1介導的血管生成作用[12]。所以，這些功能與經典的血管內皮生長因子配體的作用高度相似，提示其作為血管內皮生長因子模擬物的作用方式。

2 Gremlin促血管生成作用與臟器的關系

2.1 腎臟Gremlin在正常成人腎臟組織中幾乎不表達，在各種腎臟疾病組織中表達增加，主要位于腎小管間質纖維化的區域。Gremlin通過VEGFR2和Notch通路激活調節腎小管上皮間充質轉化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)過程，從而參與腎纖維化的發生[13]。LAVOZ等[14]從細胞水平和基因水平，發現Gremlin以不依賴于BMPs方式，與細胞中的VEGFR2結合發生磷酸化反應誘導近端腎小管上皮細胞的VEGFR2信號通路持續激活，從而誘導腎臟炎癥發生，特異性VEGFR2激酶抑制劑SU5416阻斷VEGFR2的激活，明顯減輕了腎臟炎癥。MEZZANO等[15]述了Gremlin激活腎小管間質細胞中的VEGFR2信號通路，引發了一個與腎臟炎癥反應相關的下游機制，即通過激活NF-κB信號通路調節腎臟炎癥。CORSINI等[16]證明Gremlin通過誘導一氧化氮(NO)的產生和細胞內cAMP增加，導致內皮細胞通透性升高、細胞間黏附分子增多，誘導內皮細胞產生促炎癥反應，從而引起VEGFR2介導的環腺苷磷酸-反應元件結合蛋白(CREB)激活。因此內皮細胞可能通過CREB的激活以及轉錄因子NF-κB的激活而啟動促炎癥、促血管生成的轉錄程序，調節各種血管生成因子的產生。同時MARCHANT等[17]發現，對小鼠施用Gremlin會誘導腎臟中炎性細胞出現并上調促炎性基因，從而認為促炎基因上調與其促血管生成反應密切相關。在腎纖維化疾病中，Grem1水平升高，包括急性腎損傷、糖尿病性腎病、慢性同種異體移植腎病和免疫性腎小球腎炎。Gremlin通過VEGFR2和Notch通路激活調節腎小管上皮間充質轉化(Epithelial to mesenchymal transition，EMT)過程，從而參與腎纖維化的發生[13]。CHURCH等[2]發現腎小管上皮細胞特異性Grem1靶向缺失小鼠對葉酸誘導的血管損傷具有保護作用，即Gremlin過表達的轉基因小鼠對腎損害的易感性增加。CAROLINA等[18]通過給小鼠注射Gremlin制造糖尿病腎病模型，加入VEGFR2激酶抑制劑后pVEGFR2水平明顯減低，降低了腎小球濾過屏障通透性，有助于減少蛋白尿，改善腎功能。

2.2 皮膚 皮膚傷口愈合是高度受控的細胞、體液和分子機制參與的動態過程，大致可分為3個相互重疊的階段：急性炎癥期、肉芽組織生成期、基質形成和重塑期[19]。瘢痕形成是成人皮膚傷口愈合的主要形式。瘢痕修復是肉芽組織轉化為以膠原纖維為主的瘢痕組織的過程。劉玉芳等[20]發現，在人體瘢痕組織中，Gremlin、高遷移率族蛋白B1與血管內皮生長因子的表達明顯高于正常組織，而骨形態發生蛋白7的表達呈顯著性下調。因此，Gremlin的過度表達和骨形態發生蛋白7的表達下調，以及高遷移率族蛋白B1與血管內皮生長因子的高表達可能共同促進炎癥修復、纖維化形成，但具體分子機制尚待進一步研究。

紫外線輻射是皮膚癌的致病因素，JI等[21]研究表明，Gremlin明顯減弱了紫外線所致的角質形成細胞和成纖維細胞凋亡，而且還激活VEGFR2-PI3K/AKT-Nrf2信號通路，抑制了紫外線誘導的角質形成細胞和成纖維細胞的活性氧產生和DNA損傷，加入VEGFR2抑制劑SU5416后阻斷了Gremlin的抗凋亡作用和VEGFR2磷酸化作用。因此，Gremlin可以作為一種新型的抗紫外線皮膚保護劑避免人類皮膚角質形成細胞受紫外線輻射。

2.3 心臟 人體大多數組織和器官在損傷后的再生能力非常有限。因此，包括心臟疾病在內的許多退化性疾病，組織受損后是不能再生的。心臟前體細胞移植可促進新血管生成、改善心肌梗死后的左室功能。Notch1、Jagged1這兩個分子已被證明在血管生成中發揮重要作用，而且Notch信號在調節心肌細胞增殖方面也起著重要作用，因此這兩個分子對損傷后的心臟再生起重要作用。相關研究發現，Grem2通過Smad2/3信號通路介導Notch1/Jagged1信號通路的激活促進間充質干細胞向心肌細胞分化，從而改善心梗后左室重塑，延長生存期限，降低心臟病的病死率[22]。此外，Grem2被證明可以通過激活c-Jun-N末端激酶通路誘導胚胎干細胞分化為具有心房特征的心肌細胞[4]。因此，Grem2對于心臟發育和心肌細胞分化是必不可少的，而且Grem2表達是由心臟損傷誘導的。

2.4 肺動脈高壓Gremlin在正常氣道的發育和胚胎肺循環中發揮了關鍵作用[23]。COSTELLO等[24]通過量化整個胚胎肺中轉錄物水平，發現Gremlin的表達呈動態變化，即在小鼠胚胎肺中觀察到gremlin相對高的表達水平，而在囊狀期，當間隔結構形成足以產生充足的肺泡面積進行氣體交換時，Gremlin表達明顯降低。慢性低氧性肺疾病常因肺動脈高壓復雜化。在肺動脈高壓的多種病理改變如新生內膜形成中均存在血管生成改變，與患者預后密切相關。在體和離體實驗均表明，Gremlin直接與VEGFR2結合，促進人微血管內皮細胞血管生成[24]。Gremlin作為內皮細胞釋放因子，與內皮標志物vWF共表達，在慢性缺氧SU5416建立的肺動脈高壓小鼠模型中Gremlin-1的RNA表達明顯高于對照組，且抗Gremlin-1單克隆抗體減少肺血管重構[6]。內皮細胞的BMP信號是維持正常的肺血管結構必不可少的[25]。研究發現Gremlin-1可能是肺動脈高壓一個新的生物標志物，肺內皮細胞的BMP信號通路與NO通路有交聯，而Gremlin-1拮抗BMP作用可能導致肺動脈高壓患者的NO信號通路受抑制，使中膜增厚、微血管重塑和血管周圍纖維化[26]。

2.5 視網膜病變 早產兒視網膜病變(Retinopathy of prematurity，ROP)是早產兒特有的血管增生性視網膜病變，分兩個階段進行，第一階段開始于視網膜血管的延遲生長和現有血管部分退化，然后第二階段是缺氧誘導病理性血管生成[27]。ROP模型小鼠的視網膜中，Gremlin表達明顯上調，視黃酸含量明顯升高(與血管內皮生長因子表達上調相關)，因此Gremlin表達上調與VEGF表達有關。LIU等[28]發現，在視網膜色素上皮(Retinal Pigmentation Epithelial,RPE)細胞中，Gremlin激活VEGFR2-Akt-mTORC2信號通路，促進細胞增殖、遷移和VEGF的產生，因此抗Gremlin療法可能是ROP及其他增殖性視網膜病的替代療法。增殖性玻璃體視網膜病變(Proliferative vitreoretinopathy，PVR)是由孔源性視網膜脫離引起的嚴重并發癥，也是視網膜脫離手術失敗的主要原因，其生理學特征是RPE細胞增殖、遷移和細胞外基質分子(如纖連蛋白和I型膠原蛋白)分泌增加，多種細胞因子和生長因子參與纖維化膜的形成。在本研究中，Gremlin促進RPE細胞增殖以及I型膠原和纖連蛋白的表達，而且在RPE細胞中，用siRNA沉默Gremlin基因表達可明顯抑制TGF-β1和TGF-β2誘導的I型膠原和纖連蛋白的表達。這些發現表明，Gremlin可能在PVR的發展中起重要作用[29]。

2.6 子宮內膜異位癥 子宮內膜異位癥是一種良性狀態，據報道，血管生成是該病的主要特征，該病對新的血管生成有很大的依賴性，然而，血管生成在該病中的潛在機制尚不清楚。Gremlin-1在子宮內膜異位癥的血管生成方面起重要作用，而且抗Gremlin-1單克隆抗體的免疫原性強，具有靶向作用，可用于制備篩查子宮內膜異位癥的試劑盒[30]。同時SHA等[31]研究表明，Gremlin-1在患者的異位子宮內膜的異常血管生成中起一定作用，外周血清中的GREM1水平可能是子宮內膜異位癥的前瞻性血清生物標志物。關于Gremlin在本病中與血管生成的機制研究目前仍是空白。

2.7 肝纖維化 肝纖維化是一種代償性修復反應，各種病因的慢性肝臟疾病均可導致肝纖維化的發生。病理性血管生成似乎與慢性肝病的纖維化進程具有內在聯系，最終導致肝硬化和肝癌等相關并發癥的發展。Gremlin是一種促纖維化因子，與肝纖維化等疾病有關[32]。劉匯等[33]通過構建缺氧復合脂肪性肝炎大鼠模型，發現新生血管促進了肝纖維化的形成，但具體機制仍是未知。

2.8 腫瘤 血管生成對原發性腫瘤生長及轉移至關重要，因此抗血管生成治療被認為是一種主要的抗癌治療方式[34]。GREM1是一種新型的促血管生成因子。GREM1的增加導致結腸癌易感綜合征-家族性幼年性息肉病形成，但是對于GREM1在結腸癌的表達及其相關功能的研究還很少。LIU等[35]研究發現，GREM1通過激活一個類似于VEGF-VEGFR的途徑，與VEGFR2結合，激活血管生成相關通路，從而誘導血管生成。此外，GREM1還可以在不依賴VEGF的情況下產生相應的促血管生成作用。所以，GREM1在癌細胞中具有自我更新能力。而且大腸癌(Colorectal Cancer，CRC)還可以通過VEGF非依賴性途徑分泌GREM1來促進腫瘤生長和血管生成。在結直腸癌細胞中，沉默GREM1通過BMP/SMAD信號通路和VEGF非依賴性途徑，抑制細胞增殖、遷移、血管生成和上皮間質轉化。大部分(44%)的結直腸癌病例表現為間質型GREM1，這與CRC患者淋巴管浸潤減少和臨床療效改善密切相關，這提示基質GREM1是潛在的生物標志物，可能是治療CRC的靶向療法[36]。CHEN等[37]對35例胰腺神經內分泌腫瘤的GREM1免疫組化表達和微血管密度(MVD)進行檢測，發現GREM1和高MVD的表達是重要且有利的預后因素，而且GREM1表達與高MVD明顯相關。GREM1的表達與腫瘤相關的血管生成有關，被認為是胰腺神經內分泌腫瘤的一種新的預后標志物。血管生成在垂體腫瘤生長中起重要作用，目前阻斷腫瘤血管形成的嘗試主要集中在靶向VEGF-VEGFR信號通路上。KOKOKETSU等[38]研究認為，Gremlin在垂體腺瘤組織中的高表達和CD34陽性血管的強相關性表明Gremlin與垂體腺瘤細胞的血管生成有關。SHAIK等[39]對彌漫性橋腦膠質瘤(Diffuse intrinsic pontine glioma，DIPG)患兒的研究表明，重組Gremlin-1可以激活人臍靜脈內皮細胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)和人腦微血管內皮細胞(Human brain microvascular endothelial cells，HBMECs)中的AKT表達，增加血管內皮細胞的成管能力。

3 結語

綜上所述，以上相關研究表明，Gremlin促進血管生成、炎癥修復、纖維化及腫瘤細胞增殖、遷移和上皮-間質轉化，目前相關分子機制主要與VEGFR2-PI3K/AKT通路、NO通路等有關，因此，Gremlin可能是新的生物標記物，為臨床提供治療靶點或者診療方案，但具體作用機制仍需深入研究。