移植性肺癌動物模型建立的研究進展

鄭偉珍 綜述 吳愛兵，楊志雄 審校

1.廣東醫科大學附屬醫院腫瘤中心，廣東 湛江524000；2.湛江中心人民醫院，廣東 湛江524000

肺癌是最常見的癌癥類型(占病例總數的11.6%)和癌癥死亡的主要原因(占癌癥死亡總數的18.4%)[1]。為更好了解肺癌臨床發病特征以及制定出更好、更有效的診治措施，為還原與人肺癌病因、發病機制、發展過程，需要精準模擬肺癌病理過程的動物模型。本文就目前國內外報道的肺癌移植性模型的構建方法的研究進展進行綜述，以期為肺癌相關研究提供模型參考。

1 實驗動物的選取

選取適合的實驗動物對肺癌動物模型的建立具有重要意義。用于肺癌造模的實驗動物大多為免疫缺陷動物，如免疫缺陷小鼠、大鼠、兔、犬等。目前用來研究肺癌模型建立的品種主要有：(1)正常鼠，BALB/C-裸小鼠，C57BL/6J小鼠；(2)免疫缺陷鼠：裸鼠、嚴重聯合免疫缺陷(severe combined immunodeficiency，SCID)小鼠，NOD-SCID小鼠，CB.17 SCID小鼠，無胸腺大鼠等。C57BL/6小鼠、裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠都是構建移植性肺癌轉移模型的常用品種，具體選擇哪種類型的小鼠建模，需要充分考慮實驗目的、實驗周期、接種方法以及檢測指標等因素。這幾種品系小鼠各有優勢，其中C57BL/6小鼠具有正常的免疫功能，價格低廉、耐受性強，模型成熟，常用于Lewis細胞的肺癌轉移建模型構建。裸鼠、SCID小鼠、NOD/SCID小鼠常用于人源肺癌細胞的移植性種植，小鼠成瘤率與其種類、免疫特性有著密不可分的聯系。闕祖俊等[2]將人源肺癌循環腫瘤細胞CTC-TJH-01(1×106個/只)采用尾靜脈注射的方法，注射后第8周NOD/SCID小鼠首次觀察到肺部成瘤，第10周NOD/SCID小鼠肺部成瘤率為100%，而在Nude小鼠和C57BL/6小鼠體內均不成瘤。吳健彬等[3]研究顯示NOD/SCID小鼠皮下移植瘤模型成瘤率為55.6%，高于BALB/c裸鼠的成瘤率，并且肺癌在NOD/SCID小鼠易發生肺轉移與骨轉移，NOD/SCID小鼠仍然是移植性肺轉移模型的首選品系。其可能的原因是小鼠的免疫排斥反應被人源肺癌循環腫瘤細胞的較強的免疫原性激發。Nude小鼠由于無胸腺，因此T淋巴細胞所占百分比很低，但具備B淋巴細胞及NK細胞的正常功能。C57BL/6小鼠、BALB/c裸鼠為免疫水平正常小鼠；而NOD/SCID小鼠是聯合免疫缺陷小鼠，其體內T、B淋巴細胞和NK細胞的表達極低，因而較適用于異種移植造模。

2 肺癌動物模型分類

目前主要有以下三種模型用于肺癌動物建模的研究：

2.1 誘發性肺癌動物模型 其優點是具有跟人肺癌相似的形態學、組織學以及分子生物學特征，更貼近肺癌實際發生發展原理。主要方法包括吸入、口服致癌劑以及肺或支氣管灌注或肺或支氣管黏膜下注射致癌物誘發肺癌等。YE等[4]在氣管內滴注碘油混懸液(I)和DEN，成功誘導出肺部腫瘤。近年來國外常采用此方式建模，應用于腫瘤相關預防藥物的開發實驗。但因為該方法構建較困難，誘導時長難以統一，腫瘤形成效率低，難以開展大規模研究。

2.2 轉基因肺癌模型 基因工程模型建模耗資較多、時間較長，少見相關報道。

2.3 移植性肺癌動物模型 在實驗動物體內接種腫瘤細胞或組織構建而成的腫瘤動物模型即為移植性模型。移植性模型能在同種或相近物種中反復移植，長時間保存以備研究所需，而且可批量接種等量的腫瘤細胞或組織于動物體內，增殖快慢相對統一，動物間區別較小，成瘤率高，研究所需時間較短，研究條件易調節，所以被普遍應用。但移植性動物模型難以用于早期腫瘤發生發展機制的相關研究。以研究目的、造模方式的差異為根據，可將移植性肺癌動物模型進行分類：如按接種部位，可分為原位移植模型和異位移植模型；按照腫瘤細胞的來源，可分為誘發性、自發性、移植性和轉基因動物模型等；按照轉移部位，可分為腦、骨、淋巴轉移模型。

2.3.1 異位移植模型 將肺癌細胞或組織接種于實驗動物皮下或腎包膜下或血管內即為異位移植。其易于動態測量瘤塊大小、增殖進程，且移植成功率較高。潘泓等[5]研究發現，與皮下移植相比，腎包膜下移植成瘤率較高，但因實驗技術更為復雜，對實驗動物有較大損傷，且因腎包膜及其脆弱，導致操作容易失敗，因此極少應用。除此之外，不可直觀測量腫瘤的形態、體積也是腎包膜下移植的顯而易見的不足之處。

2.3.1.1 皮下移植瘤模型 在當前的肺癌模型研究中，皮下移植型模型仍是最為多見的。把肺癌組織、細胞注入免疫缺陷動物皮下的方式已經成為以往數十年對惡性腫瘤進行研究的首選途徑。皮下移植瘤可在不同部位進行，其可導致腫瘤轉移性、成瘤特點等方面產生差異，例如背部、腋部、后肢等，其中以腋部皮下移植最常采用。小鼠肺癌皮下移植瘤是當前檢測腫瘤相關藥物的重要臨床前工具，因為其操作簡單、成瘤率高、不影響動物活動且可動態測量等優點。有研究在小鼠不同部位(右腋皮下、右腹股溝皮下、腳墊皮下)分別注入穩定表達螢光素酶的小鼠Lewis肺腺癌細胞，結果顯示腋下組腫瘤體積增長穩定，較晚才出現壞死，且肺轉移率最高，更適用于實驗時間較長、需要觀察轉移灶的實驗。皮下移植造模的方法盡管已較多采納，同時，也存在不足之處，正因為肺臟與皮下所處內環境存在天壤之別，肺癌細胞一些特性蛋白及因子表達受其原發腫瘤部位差異的影響，表現在局部侵犯、遠處定植尤為明顯。進行體內實驗或藥物篩選時，應用皮下移植瘤模型得出的結果與實際臨床藥效存在極大差異。所以，選取異位造模時，為避免產生藥物療效的假陽性，在抗腫瘤治療藥物研究時，應將某些與藥物敏感性有關的特異表達是否可能因腫瘤生長部位差異而不同考慮進去。

2.3.1.2 血管內注射DENG等[6]在雌性裸鼠體內通過尾靜脈注入A549單細胞懸液，結果在小鼠體內發現肺部轉移瘤，病理顯示為肺腺瘤。另外，有研究經裸鼠尾靜脈將腫瘤細胞注入裸鼠內，分別于第5、11周觀察到肺部轉移、惡病質，研究過程無小鼠死亡。

2.3.1.3 左心室注射 為構建腦轉移模型，多個研究表明與左心室注射相比，尾靜脈注射更易形成肺病灶，而左心室注射更易形成腦轉移[7]。曾有研究者大膽猜想，采用左心室內注射的方法能使肺部轉移灶出現的幾率和數量下降，使腦轉移形成率大大提高，其機理可能是因為通過左心室內注射，更多腫瘤細胞可直達腦部形成腦轉移灶，而尾靜脈注射法中肺部毛細血管網最先捕捉肺癌細胞從而在肺內定植，導致肺部病灶出現。

2.3.2 肺癌原位模型 在動物呼吸系統中接種一定數量的肺癌細胞懸液或瘤塊，進而原位成瘤及產生轉移灶的建模方法即為肺癌原位模型。與異位皮下接種相比，原位肺癌因其可效仿肺癌臨床腫瘤發生機制、遠處轉移、胸水發生及模擬腫瘤的微環境，在肺癌診治實驗有著重大意義。這個也側面體現了種子土壤學說，即肺癌細胞的生長、轉移具備器官特異性。與此同時，胸膜播散、氣胸、血胸是原位移植造模的主要危險。

2.3.2.1 肺臟原位移植模型 肺內移植方法已成為最近幾年研究的熱門，成為較合適的造瘤模型，因其移植成功率高，而且能最大程度模擬肺癌微環境，與人類肺癌的生物學行為相近。與此同時，原位移植對時間周期長、操作技術要求高、對腫瘤生長的監測難度大。隨著科技進步，在經皮穿刺瘤塊移植過程中，運用CT引導有動物損傷小、成功率高等優勢，因此被廣泛應用。

2.3.2.2 支氣管原位移植模型HAI等[8]通過氣管切開，往右側支氣管用導管注入腫瘤細胞懸液，從而實現原位建模。結果顯示，肺癌細胞原位建模能轉移到腦、腎、骨骼等全身多個部位。另外，國內有學者在SCID小鼠及裸大鼠一側肺內通過氣管、胸壁穿刺兩種方法接種肺癌細胞，從而構建肺癌原位模型[9]。經支氣管原位建模，其生理學特性與臨床肺癌實際發生發展機理最為接近，應用于肺部腫瘤實驗更為恰當。遺憾的是，成瘤數量、大小不穩定、操作難度大、成瘤率較低等缺陷使氣管內移植的發展應用受到極大局限。

2.3.2.3 胸腔原位移植模型 胸腔內注射肺癌細胞懸液進行小鼠原位肺癌造模的較高效、簡單易行的方式之一。ZHENG等[10]采用胸腔注射法將腫瘤細胞注入裸鼠左肺，應用CT掃描進行動態觀察。原位肺癌動物模型的腫瘤形成率為90%，腫瘤轉移率為100%。相比而言，胸腔原位種植法建模相對異位皮下腫瘤模型更難以實時動態觀察，需要借助CT影像學輔助，而且價格較昂貴。

2.3.2.4 肺內和胸膜同步移植模型 文石兵等[11]將在裸鼠皮下、肺內及肺內和胸膜腔分別注入人肺腺癌細胞，結果顯示，與單純肺內移植組相比，胸水發生率更高，且存活時間更久，而皮下組無胸水、轉移灶產生。因此，兩部位同步移植法進行造模，可較大程度還原肺部浸潤、轉移的臨床特點，可用于探討肺癌胸腔積液診治機理的實驗。

2.4 肺癌轉移模型

2.4.1 腦轉移模型 腦是肺癌較為多見的轉移部位之一。腦轉移癌動物模型可通過尾靜脈、頸內動脈、顱內局部、左心室注射等途徑。吳濤等[12]在裸鼠顱內植入人SCLC細胞懸液，造模成功后經病理證實為腫瘤組織。造模成功率高是顱內局部接種的顯著優點，但同時也存在不少缺陷，例如難以還原腫瘤形成過程，即無法模擬肺癌細胞的轉移過程中隨著血液流動形成腦轉移病灶等一系列步驟。陳愉生等[13]通過應用胸腔原位及左心室注射法，將PC9細胞注入裸鼠，結果兩組腦轉移率分別為11.1%、100%，充分證明胸腔原位注射法相比，左心室注射法腦轉移率更高。

2.4.2 骨轉移模型 肺癌患者，骨轉移是肺部腫瘤較為多見的轉移位置，轉移率為30%～40%。當前而言，應用較多的肺癌骨轉移造模有以下幾種方法：

2.4.2.1 血管內注射KUCHIMARU等[14]經尾動脈注射和心內注射兩種方法，結果顯示與心內注射相比，應用尾動脈注射法的腫瘤細胞運輸效率為其3倍，且向小鼠下體器官具有顯性傳遞性，而心內注射則導致癌細胞則擴散到各種組織。與心內注射相比，尾動脈注射組的小鼠骨量大大減少。生存期檢測顯示，心內注射的小鼠注射后在25 d死亡率為100%，而尾動脈注射組小鼠生存期大于32 d。而后，多名學者經尾動脈注射法成功進行了肺癌骨轉移造模，且成功率較高，提示該方法是肺癌骨轉移造模的可行方法之一。

2.4.2.2 心室內接種DAVID等[15]通過左心室注射法構建A549細胞肺癌模型，使小鼠自發形成骨轉移。YANG等[16]通過左心室注射法建立肺癌自發轉移的模型，接種一周后給予生理鹽水或不同劑量的氟伐他汀干預，結果提示氟伐他汀可以抑制肺腺癌細胞其是骨骼的轉移。

2.4.2.3 骨髓腔內注射 在骨髓腔內注射腫瘤細胞即骨內接種：其耗時短、費用低，可用于較長期的研究，且實驗期間內不會發生其他臟器組織轉移，較適于進行藥物實驗。但關于其為原發或轉移腫瘤的討論仍無法統一意見。這種方法可效仿肺癌細胞在骨內生長的狀況，但其缺陷是難以還原轉移經過。SONN等[17]的研究在裸鼠L5椎體骨內注入肺腺癌細胞，病理證實為L5椎體腫瘤侵犯，實現了肺癌單純性椎體轉移建模，在C57BL/6小鼠右后肢脛骨平臺下注射腫瘤細胞，然后進行短暫免疫抑制，從而模擬肺癌骨轉移過程，結果顯示，在制備小鼠肺癌骨轉移模型，免疫抑制劑的中、高劑量組成瘤率較高，但相對而言，中等劑量組小鼠有較高的存活率。通過骨內接種建立骨轉移模型，操作技術相對易行，但因骨轉移率低，少見與此相關的報道。

2.4.3 淋巴道轉移 有研究報道，在裸鼠不同部位(左側背部近腋窩、右側背部近腋窩、左側后肢和左后爪墊皮下)注入腫瘤細胞，結果顯示左側背部近腋窩注射成瘤率高，淋巴轉移率高，簡便易行，為通過皮下造模從而導致淋巴結轉移的最優先選擇部位[18]。

3 進展

3.1 選擇模型物種的創新 兔：相對于鼠而言，兔本身VX2肺癌細胞株具有與人源肺癌極其相似的形態及生理行為，且無自身免疫源性，所以被普遍運用于兔肺癌建模。狗：因為適于在大動物體內生長的瘤株難于找到，因此難進行大動物模型的相關實驗。犬傳染性性病腫瘤(CTVT)細胞作為新近的動物實驗模型研究的熱點，其含有穩定、獨特的生理特點，可以穿透細胞屏障，躲避體內免疫監視定植從而生長為腫瘤病灶。

3.2 移植性肺癌動物模型制方法改進 微創胸腔穿刺進行肺癌造模簡單易行，失敗率低，對動物損傷低，但針拔出時肺癌細胞易外溢，致胸腔播散，降低了獨立結節形成率，難以評估、監測。最近數年移植方法的改進為減少腫瘤細胞播散帶來曙光。

3.2.1 雙針共軸瘤塊原位移植 有研究報道，在兔體內，CT輔助下運用雙針共軸法將肺癌組織接種至兔體內[19]。相比單針移植，雙針使胸腔播散率大大下調，而肺孤立結節形成率上升，更有利于實驗的檢測和評估。肺內孤立VX2成瘤率在該研究組為80%，而在林曉南[20]的報道中，則分別為75%和70%，顯而易見共軸穿刺法更勝一籌。

3.2.2 膠原蛋白海綿條 劉宇等[21]用兩條可生物降解的膠原海綿條前后包埋瘤塊，形成“三文治”結構，再運用胸腔穿刺術植入將其植入兔內，能有效避免瘤塊播散導致胸腔種植。

3.2.3 親水凝膠 李欣等[22]在實驗動物體內移植包含瘤塊的親水凝膠，防止腫瘤細胞的播散。并且，其可提高瘤塊與實驗動物肺上皮細胞的的接觸面積，因為凝膠有親水性，可吸收水分而膨漲。

3.3 高轉移細胞株的獲取CUI等[23]在裸鼠皮下內接種從中國肺癌患者腹水中提取的腫瘤細胞，1個月后切除原發腫瘤，將其接種至新小鼠皮下，反復傳代，并檢測各代腫瘤細胞進行轉移率，第一、二、三代分別為30%、60%、90%，得到轉移效率較高的瘤株，從而后續建模提供保障。

3.4 肺癌組織PDX模型的研究進展 研究報道顯示，肺癌細胞在體外反復傳代可致一些基因發生篡改，而且，細胞經過消化酶處理后，細胞生理特性會產生變化。親代肺癌組織的微環境及生理特點可被保存通過PDX模型的建立[24-26]。在免疫缺陷動物體內接種手術或穿刺組織而來的肺部瘤塊進行造模即肺癌PDX。新鮮腫瘤組織能立即造模(普遍要求1 h內植入)也可低溫保存復蘇使用。瘤塊大小不等，2 mm3[27]、15～30 mm3[28]均見報道。瘤塊混合基質膠再一起接種，若肺癌組織樣本量低，則需先混合基質膠進行離心，再植入免疫動物。PDX模型能使腫瘤微環境被最大程度保存。由于PDX模型更貼近人肺癌組織環境，所以越來越受到重視，可能是未來研究肺癌動物模型的方向[29-31]。

4 結語

綜上所述，移植性肺癌轉移模型是進行肺癌研究的重要支撐，傳統的移植性肺癌轉移模型主要以皮下移植為主，但是肺臟與皮下所處內環境存在天壤之別，不能精準模擬肺癌的發生發展過程，因此還不能完全滿足我們的需要。目前新的移植性動物模型例如PDX模型越來越受研究人員的青睞，因其最大限度的保留親代肺癌組織的微環境及生理特點，同時相比肺癌原位接種操作相對簡單，可能是未來移植性肺癌模型研究方向。