基于網絡藥理學分析疏肝健脾解毒方抗乳腺癌潛在靶點和作用機制

★萬杰鑫 趙斌 胡慧明 吳雙雙 官揚（.南昌市第三醫(yī)院 南昌 330009；.江西中醫(yī)藥大學 南昌 330004）

乳腺癌在我國女性中發(fā)病率逐漸升高，并逐漸呈現年輕化，其已成為女性腫瘤發(fā)病率增長最快的一種腫瘤，嚴重危害女性健康［1-2］。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是多種危險因素共同作用引起的［3］，化療和手術是治療乳腺癌的主要手段，但化療導致嚴重的毒副作用，且手術給患者帶來較大創(chuàng)傷。近年來，中醫(yī)藥預防和輔助西醫(yī)治療乳腺癌方面體現出良好的優(yōu)勢。

中醫(yī)認為肝郁證是乳腺癌癌前病變中醫(yī)的重要病證。李琳霈等［4］認為肝郁脾虛、瘀毒內結是引起乳腺癌癌前病變的重要病機之一。中藥疏肝健脾解毒方在疏肝理氣、軟堅散結、活血化瘀、消腫止痛等方面有較好的療效，具有預防和治療乳腺癌作用［5］。有研究證實疏肝健脾解毒方可能通過誘導細胞凋亡，達到抑制人乳腺癌細胞MCF-7的增殖，且可有效降低乳腺癌癌前病變肝郁證大鼠模型血清中性激素水平［6-7］。白術、茯苓、郁金、柴胡健脾疏肝、行氣解郁；蒲公英、白花蛇舌草、半枝蓮清熱解毒、消腫散結，該方扶正抗癌，標本同治。

白花蛇舌草性寒、味微苦；半枝蓮性寒、味辛微苦。二者皆屬清熱解毒類中藥, 具有清熱利濕、涼血解毒、軟堅散結等功效。研究表明二者在制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、增強機體免疫、降低端粒酶活性等方面起到協(xié)同作用［8］。郁金為姜科姜黃屬植物溫郁金（Chrcuma wenyujinY.H.chenet C.ling）、姜黃（Curcuma lougaL）、廣西莪術（Curcumak wangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang）、或蓬莪術（CurcumaphaeoeaulisVal.）的干燥塊根, 藥用歷史悠久。其藥性寒, 味辛, 苦, 歸心、肝、膽經, 具有活血行氣鎮(zhèn)痛、消心解郁、利膽退黃、涼血止血之功效。臨床診療表明郁金的提取物能夠有效抑制多種腫瘤細胞的生長、減少腫瘤細胞數目、縮小腫瘤細胞體積［9］。中藥柴胡是狹葉柴胡（BupleurumscorzonerifoliumWilld.）或傘形科植物柴胡（Bupleurum chineseDC）的干燥根，味辛、苦，性微寒，有抗炎、抗菌、抗腫瘤等功效［10］，多項研究表明柴胡可逆轉腫瘤多藥耐藥，其聯(lián)合化療藥物治療乳腺癌可降低化療藥物的副反應，對乳腺癌患者的預后起到一定的改善效果［11-13］。茯苓［Poria cocos（Schw.） Wolf］為我國傳統(tǒng)的藥用真菌, 是多孔菌科臥孔菌屬真菌茯苓的干燥菌核, 其主要成分為茯苓糖，胡康等［14］報道了茯苓提取物通過抑制SATB1來降低MDA-MB-231乳腺癌細胞的體外遷移能力，進而控制乳腺癌的發(fā)展。白術（Atractylodes macrocephalaKoidz.） 為健脾益氣類中藥，具有調節(jié)胃腸功能、抗衰老、抗炎、抗腫瘤、提高免疫力、保肝以及改善和治療糖尿病的作用。LEE等［15］研究發(fā)現白術能夠提高腫瘤患者的免疫力，進而抑制腫瘤細胞的生長繁殖從而達到抗腫瘤的作用。蒲公英為菊科植物蒲公英（Taraxacum mongolicumHand.-Maz.）、堿地蒲公英（Taraxacum borealisinenseKitam.） 或同屬數種植物的干燥全草；其味苦、甘, 性寒, 歸肝、胃經, 具有清熱解毒、消腫散結、利尿通淋的功效, 可用于乳癰、肺癰、腸癰、熱淋澀痛、濕熱黃疸、清肝明目［16］。研究表明蒲公英萜醇可通過線粒體途徑誘導乳腺癌細胞凋亡，進而對乳腺癌細胞起抑制作用［17］。

中藥的治療作用涉及多成分、多靶點的綜合調節(jié)作用，疏肝健脾解毒方預防和治療乳腺癌的作用機制研究多集中在臨床研究或細胞學層面，但缺乏多層次多層面抗乳腺癌的作用機制研究。網絡藥理學從多成分、多靶點和多通路等多個方面研究中藥復方作用機制，為中藥研究提供了新思路［18］。本研究采用網絡藥理學方法分析疏肝健脾解毒方抗乳腺癌的作用機制，為深入開展疏肝健脾解毒方預防和治療乳腺癌的基礎實驗研究及臨床治療提供依據。見圖1。

圖1 技術路線圖

1 材料與方法

1.1 疏肝健脾解毒方化學成分的收集疏肝健脾解毒方有郁金、柴胡、茯苓、白術、白花蛇舌草、半枝蓮、蒲公英。依托中藥系統(tǒng)藥理學數據庫和分析平臺（http://lsp.nwu.edu.cn /tcmsp.php）、中草藥綜合數據庫TDT（http://tcm.cmu.edu.tw）檢索疏肝健脾解毒方的主藥成分。以口服生物利用度（OB）， 類藥性（DL）為限制條件進行活性成分篩選［19-20］，以 OB≥30 %且 DL≥0.18 為篩選閾值得到疏肝健脾解毒方的活性成分。

1.2 乳腺癌差異基因的收集設定“breast cancer normal”為關鍵詞，物種來源限定“Homo sapiens”，通過美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）基因表達數據庫 （http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）獲得乳腺癌差異基因。

1.3 疏肝健脾解毒方活性成分-作用靶點網絡的構建利用TCMSP數據庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）預測疏肝健脾解毒方活性成分的作用靶點，通過Perl語言（https://www.perl.org/）對所獲得的預測靶點蛋白名進行轉換成相對應的基因名，并剔除重復靶點。并通過 Cytoscape 3.7.2 軟件（http://www.Cytoscape.org/）構建疏肝健脾解毒方活性成分-作用靶點網絡。

1.4 疏肝健脾解毒方-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡構建依據“1.2”“1.3”所得結果，應用Cytoscape 3.7.2中的關聯(lián)（Merge）功能，將2個結果合并成疏肝健脾解毒方-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡圖，成分作用靶點圖和疾病靶點圖交集部分即是活性成分抗乳腺癌的關鍵靶點，通過Network Analyzer工具計算網絡拓撲參數，以探索疏肝健脾解毒方抗乳腺癌的作用機制。以180≤NW≤500，OB≥30 %，DL≥0.18為 篩選條件，篩選疏肝健脾解毒方中的791種成分，并與有靶點蛋白的活性成分進行交叉對比，篩選出重合物質進行分子對接，進一步驗證活性成分與關鍵靶點的結合效果。

1.5 乳腺癌靶點PPI網絡構建及分析將乳腺癌靶點導入Cytoscape中的插件“BisoGenet”，分析其靶點蛋白質與蛋白質的相互作用（proteinprotein interaction，PPI）。利用節(jié)點的度中心性（degree centrality，DC）和介數中心性（betweenness centrality，BC）能夠識別關鍵蛋白［21］，對PPI網絡進行度中心性（DC）、介數中心性（BC）拓撲結構分析。

1.6 GO與KEGG通路 富 集分 析利 用R語 言對藥物靶點基因進行Gene Ontology（GO）和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）Pathway富集分析。以P<0.05為篩選標準確定藥物靶點基因參與的生物學過程和通路，尋找可能的作用通路。選擇 GO 功能中的生物過程、分子功能和細胞成分共參數對基因進行富集分析。采用 omicshare平臺（http://www.omicshare.com/）對 KEGG 通路富集分析結果以高級柱狀圖進行可視化。

2 結果

2.1 疏肝健脾解毒方活性成分的篩選通過在 TCMSP 及TDT平臺檢索，并將2個數據庫篩選結果合并，共獲得疏肝健脾解毒方共有791種成分，其中郁金222種，柴胡349種，茯苓34種，白術55種，白花蛇舌草37種，半枝蓮94種，蒲公英0個。將化學成分的口服利用度（OB）和類藥性（DL）的閾值分別設置為OB≥30 %，DL≥0.18獲取方中主藥的成分，獲得82種主要活性成分。見表1-2。其中郁金10個、柴胡14個、茯苓15個、白術7個、白花蛇舌草7個、半枝蓮26個、蒲公英0個，預測靶點共239個。活性成分中β-谷甾醇為郁金、白花蛇舌草、半枝蓮共有的成分；谷甾醇為半枝蓮、郁金共有的成分；黃芩苷為柴胡、半枝蓮共有成分；豆甾醇是柴胡、白花蛇舌草、半枝蓮共有的成分；槲皮苷是柴胡、白花蛇舌草、半枝蓮共有的成分。從表1-2可見郁金中化合物莪術內酯，（Zedoarolide B）在82個候選化合物中具有最高的OB值（135.56 %），半枝蓮中Stigmasta-5，22-dien-3-ol-acetate在82個候選化合物中具有最高的DL值（0.86），根據DL和OB值篩選前10化合物的結構。見圖2-3。

表1 疏肝健脾解毒方中DL值前10的化合物基本信息

表2 疏肝健脾解毒方中OB值前10的化合物基本信息

2.2 乳腺癌差異基因獲取及篩選通過在基因表達數據庫（GEO）中檢索基因芯片信息平臺GPL14550，利用R語言（https://www.r-project.org/）篩選差異基因，篩選標準為P<0.05和|logFC|>1，并結合相關文獻共得到689個乳腺癌差異表達基因，其中上調基因316個，下調基因373個。見圖4。取前40個差異最明顯的基因構建分層聚類圖。見圖5。圖5中每列代表樣本，其中類型為“C”（conNum）為對照組，類型為“T”（treatNum）為實驗組。每行代表差異基因，顏色由綠到紅代表基因的表達情況，即由低表達到高表達。

圖2 疏肝健脾解毒方中DL值前10的化合物

圖3 疏肝健脾解毒方中OB值前10的化合物

圖4 差異基因的火山圖

2.3 “活性成分-靶點”網絡的構建依據TCMSP平臺，檢索疏肝健脾解毒方的51個主要活性成分的靶點，共239個。借助Cytoscape 3.7.2軟件構建“活性成分-靶點”網絡。見圖6。度值大小與疏肝健脾解毒方活性成分作用于該靶點的可能性大小呈正比。圖6中共有288個節(jié)點，1 150條邊，中間粉色橢圓代表活性成分，活性靶點為藍色平行四邊形狀，分布于四周。

2.4 “藥物-活性成分-關鍵靶點-疾病”網絡通過Cytoscape 3.7.2軟件中的Merge功能將成分-靶點網絡和疾病靶點相互作用網絡合并，得到與乳腺癌相關的疏肝健脾解毒方活性成分的潛在靶點，見表3，構建疏肝健脾解毒方-活性成分-關鍵靶點-疾病網絡圖。見圖7。該網絡總共包含38個節(jié)點，45條邊。橙色節(jié)點代表乳腺癌藥物靶點基因，有21個；綠色節(jié)點代表白花蛇舌草，有1個；黃色節(jié)點代表白術，有1個；藍色節(jié)點代表半枝蓮，有9個；紫色節(jié)點代表柴胡，有2個；粉色節(jié)點代表郁金，有1個；紅色節(jié)點為3種中藥組成（其中MOL000098、MOL000449為白花蛇舌草、半枝蓮、柴胡共有的成分；MOL000358為白花蛇舌草、半枝蓮、郁金的共有成分），有3個。主要的網絡拓撲參數如下：網絡直徑（Network diameter）為6，平均相鄰數目（Avg.number of neighbors）為2.368。圖7結果進一步表明，白花蛇舌草的2-甲氧基-3-甲基-9,10-蒽醌作用于β-2腎上腺素能受體；白術的3β-乙酰氧基蒼術堿作用于β-2腎上腺素能受體；半枝蓮的5-羥基-7,8-二甲氧基-2-（4-甲氧基苯基）色酮、7-羥基-5,8-二甲氧基-2-苯基-色酮、白楊素-5-甲醚、漢黃芩素、三裂鼠尾草素、薺苧黃酮作用于β-2腎上腺素能受體，黃芩素、木犀草素作用于基質金屬蛋白酶-9，（2R）-5,7-二羥基-2-（4-羥基苯基）鉻-4-酮作用于糖皮質激素受體，漢黃芩素作用于轉錄因子AP-1、間質膠原酶，黃芩素作用于原癌基因c-Fos，木犀草素作用于轉錄因子AP-1、間質膠原酶、桿狀病毒IAP重復蛋白-5、肝細胞生長因子受體；柴胡的山奈酚作用于轉錄因子AP-1、間質膠原酶、信號轉導與轉錄激活因子1-α/β、醛縮酮還原酶、抗白細胞蛋白酶，蓽澄茄素作用于β-2腎上腺素能受體；郁金的柚皮素作用于過氧化氫酶。

圖5 差異表達的基因熱圖

以180≤NW≤500，OB≥30 %，DL≥0.18為篩選條件，篩選疏肝健脾解毒方中的791種成分，并與表3中所含蛋白進行交叉對比，篩選出重合物質共15種。將該15種物質分別與相應基因（度值>1）進行分子對接，見表4。總分大于4的認為該物質可能起作用，故得出結論：beta-sitosterol（β-谷甾醇），Stigmasterol（豆甾醇），Cubebin（蓽澄茄素），3β-acetoxyatractylone（3β-乙酰氧基蒼術堿）可能作用于ADRB2基因；beta-sitosterol（β-谷甾醇）可能作用于JUN基因；luteolin（木犀草素），quercetin（槲皮素）可能作用于MMP9基因；betasitosterol（β-谷甾醇）可能作用于PRKCA基因；quercetin（槲皮素），kaempferol（山奈酚）可能作用于STAT1基因；quercetin（槲皮素）可能作用于BIRC5基因。

圖6 疏肝健脾解毒組方-靶點網絡

表3 與乳腺癌相關的疏肝健脾解毒方活性成分的潛在靶點

表4 分子對接結果

圖7 疏肝健脾解毒方-乳腺癌靶點網絡

2.5 PPI網 絡構建利 用Cytoscape 3.7.2的 插 件BisoGenet，得到乳腺癌相關靶點蛋白質1914個， 33614條邊，見圖8A；對其進行度中心性（DC）拓撲結構分析，限定Degree最小值為61，得到乳腺癌相關靶點蛋白質296個，8310條邊，見圖8B；再進行介數中心性（BC） 拓撲結構分析，限定Degree最小值為600，得到乳腺癌相關靶點蛋白質22個，149條邊。見圖8C。

PPI網絡結構圖進一步顯示，疏肝健脾解毒方有可能作用于異核核糖核蛋白U、E3泛素蛋白連接酶、Myc-原癌基因蛋白、組蛋白乙酰轉移酶、過渡內質網ATP酶、COP9信號體復合物亞基5、DNA復制許可因子、內質網伴侶BiP、多泛素-C、核苷胺、細胞腫瘤抗原p53、組蛋白脫乙酰酶1、乳腺癌I型易感蛋白、雌激素受體、熱休克蛋白90α、細胞周期蛋白依賴激酶2、生長因子受體結合蛋白2、14-3-3蛋白ζ/δ、連環(huán)蛋白β-1、熱休克蛋白90β、高親和力神經生長因子受體、表皮生長因子受體。

圖8 乳腺癌靶點PPI網絡

2.6 潛在靶點基因GO生物功能及KEGG通路富集分析對疏肝健脾解毒方的組方活性成分-潛在靶點網絡中的21個靶點進行GO生物功能富集分析，結果選取前20個。靶點基因富集結果顯示：主要有20條生物學過程（BP），20個分子功能相關過程（MF），6個細胞組分（CC）表達過程。見圖9-11。GO富集分析進一步顯示：疏肝健脾解毒方治療乳腺癌的核心基因的GO功能主要涉及對活性氧的反應、氧化應激反應、細胞對氧化應激的反應、含膠原的細胞外基質、DNA結合轉錄激活活性-RNA聚合酶II特異性、核心啟動子結合、絲氨酸型內肽酶活性等。

KEGG通路富集分析顯示，疏肝健脾解毒方活性成分-潛在靶點網絡中的21個靶點主要富集在47條信號通路，根據P<0.05篩選出前20條。見圖12。其中放松信號通路、L-17信號通路、乙型肝炎信號通路、類風濕性關節(jié)炎信號通路、糖尿病并發(fā)癥中的年齡-年齡信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、安非他明成癮信號通路、結直腸癌信號通路、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染信號通路、癌癥中的轉錄失調信號通路、阿米巴原蟲病信號通路、癌癥蛋白多糖信號通路、膀胱癌信號通路、流體剪切應力和動脈粥樣硬化信號通路、MAPK信號通路、幽門螺桿菌感染的上皮細胞信號通路、利什曼病信號通路、ErbB信號通路、粘附斑激酶信號通路、PD-L1的表達與PD-1的檢測通路可能為疏肝健脾解毒方抗乳腺癌的關鍵信號通路，提示疏肝健脾解毒組方可能通過以上各通路協(xié)調發(fā)揮作用。

利用Cytoscape 3.7.2將活性成分、靶點、關鍵信號通路進行可視化分析，得到與乳腺癌相關的疏肝健脾解毒組方活性成分-潛在靶點-信號通路網絡。見圖13。

圖9 潛在靶點基因的BP分析

圖10 潛在靶點基因的MF分析

圖11 潛在靶點基因的CC分析

圖12 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖13 與乳腺癌相關的疏肝健脾解毒組方活性成分-潛在靶點-信號通路網絡

3 討論

乳腺癌是女性中最常見的癌癥，是導致女性第二大癌癥死亡的疾病，占所有女性惡性腫瘤的比例達8 %~12 %［22］。乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展是多種危險因素共同作用引起的，呈現多樣性。我國中醫(yī)認為產生乳腺癌的內因為正氣不足, 氣血虧虛，外因為外毒侵襲，情志內傷致肝脾郁結, 最終氣血瘀滯, 痰瘀互結于乳房而致病［23］。中藥疏肝健脾解毒方具有疏肝解郁、活血化瘀、清熱解毒之功效，起到預防和治療乳腺癌作用。本研究通過構與乳腺癌相關的PPI 網絡、疏肝健脾解毒組方活性成分-預測靶點網絡，從而構建與預防和治療乳腺癌相關的組方活性成分-潛在靶點網絡，進一步分析疏肝健脾解毒組方預防和治療乳腺癌的作用機制。

與抗乳腺癌相關的疏肝健脾解毒組方活性成分-潛在靶點網絡包括21個靶點，分別是STAT1、SLPI、PRKCA、PLAT、NR3C1、MYC、MMP9、MMP3、MMP1、MET、MAOA、JUN、FOS、CXCL2、COL3A1、COL1A1、CAT、BIRC5、AKR1C3、ADRB2、ADRA2A。其中，度值大于1的 關鍵 靶 點 為ADRB2、JUN、MMP1、MMP9、PRKCA、FOS、STAT1、BIRC5。推測疏肝健脾解毒組方預防和治療乳腺癌的作用機制很可能與這些靶點有關。

在靶點基因的 KEGG 通路富集分析中，篩選得到 47條信號通路，其中主要的信號通路為信號轉導通路，包括放松信號通路、IL-17信號通路、MAPK信號通路、ErbB信號通路、PD-L1的表達與PD-1的檢測通路；腫瘤相關信號通路包括腫瘤壞死因子信號通路、結直腸癌信號通路、癌癥中的轉錄失調信號通路、癌癥蛋白多糖信號通路、膀胱癌信號通路等。因此，推斷疏肝健脾解毒組方預防和治療乳腺癌的機制很可能與這些信號通路有關。

綜上所述，本研究通過結合網絡藥理學方法從多成分、多靶點和多通路的角度探索疏肝健脾解毒組方預防和治療乳腺癌的機制，為下一步進行的作用機制相關實驗研究提供了基礎，疏肝健脾解毒組方具體的作用機制仍有待未來進一步實驗驗證與研究。