核因子E2相關因子2通路在間質性膀胱炎中的研究進展

倪 斌 沈百欣 衛中慶

間質性膀胱炎(interstitial cystitis, IC)又稱為膀胱疼痛綜合征(bladder painful syndrome, BPS)，是一種慢性炎癥性膀胱病變，臨床表現為與膀胱充盈相關的疼痛或盆腔不適，伴有下尿路癥狀如尿頻或尿急。全球范圍內報道的發生率有明顯差異，如歐美地區發生率可達2.7%～6.5%，亞太地區約為0.10%～0.26%，女性患者比例高于男性[1，2]。與其他類型的慢性膀胱炎比較，目前臨床上對于IC的病因、定義及診斷標準均尚未達成共識。近年來研究顯示，該疾病可能與氧化應激相關通路的激活密切相關，氧化應激損傷導致膀胱氧化代謝性活動和抗氧化的生理保護機制之間的平衡受到破壞[3]。其中，核因子E2相關因子2(nuclear factor E2-related factor 2, Nrf2)通路，作為氧化應激反應中最為重要的轉錄因子，參與調節多種抗氧化基因的轉錄表達，對于研究IC的發生、發展具有重大意義。本文就Nrf2通路在IC中的研究進展進行綜述。

一、Nrf2通路的概述

1.Nrf2的蛋白結構：Nrf2是一種包含605個氨基酸，由7個結構域(Neh1～7)組成的轉錄因子。Neh1結構域負責Nrf2與抗氧化元件序列的正確結合，N末端的Neh2結構域介導了Nrf2負調控因子Keap1和賴氨酸殘基的相互作用并參與調節Nrf2的泛素化和蛋白降解，C末端的Neh3負責染色質重塑后的反式激活，Neh4和Neh5均為轉錄激活結構域，負責促進Nrf2轉錄。此外，Neh6結構域參與負反饋調節Nrf2穩定性，Neh7結構域則參與抑制Nrf2的轉錄活性[4]。

2.Nrf2相關機制通路：細胞內Nrf2的豐度受到Keap1的嚴格調控，在正常生理情況下，兩個Keap1分子在ETGE和DLG基序處與Nrf2的Neh2域結合，并將Nrf2隔離在細胞質中。響應于應激條件，Keap1失活促進了Nrf2從Keap1的解離并易位至細胞核中與sMaf蛋白結合，Nrf2-sMaf復合物以序列特異性方式與Nrf2靶基因的啟動子區域中的抗氧化劑反應元件(5′-TGACXXXGC-3′)結合，并啟動一系列抗氧化基因表達，如NAD(P)H：醌氧化還原酶1(NADPH: quinone oxidoreductase 1,NQO1)、血紅素加氧酶-1(heme oxygenase 1,HO-1)等。除Keap1外，Nrf2活性還受p62/SQSTM1的調節，應激條件下p62上調，從而螯合Keap1使Nrf2解離并易位入核[5]。另外，Nrf2活性也可以通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶糖原合酶激酶3(GSK-3)和E3連接酶銜接子β-TrCP介導的蛋白酶體降解機制控制，GSK-3在其Neh6域中磷酸化Nrf2，以促進β-TrCP識別Nrf2，從而促進Nrf2蛋白降解。

3.Nrf2參與調控的下游基因:(1)血紅素加氧酶-1:由HMOX1基因編碼的血紅素加氧酶-1是一種可誘導的抗氧化酶，它可以催化血紅素分子的分解從而導致游離Fe2+的釋放，為了防止羥自由基的形成，與HMOX1上調的同時，Nrf2增強了編碼鐵蛋白復合物的組分基因的表達，鐵蛋白復合物將Fe2+氧化為Fe3+，從而發揮解毒作用[6]。(2)NAD(P)H：醌氧化還原酶1:NAD(P)H：醌氧化還原酶1是一種普遍存在的胞質Ⅱ期生物轉化酶，其主要生理學作用是催化醌的兩電子還原并發揮解毒作用，NQO1基因敲除小鼠IC模型表現出膀胱組織活性氧(reactive oxygen species, ROS)增加，能量代謝和黏附因子改變以及線粒體結構喪失，這些因素共同導致凋亡細胞死亡增加及尿路上皮丟失[7]。(3)硫氧還蛋白：硫氧還蛋白是一種蛋白質二硫鍵還原酶，可作為抗氧化劑保護蛋白質免受氧化應激的影響，從而促進蛋白質折疊，通過亞硝基化作用調節細胞凋亡并調節炎癥。(4)谷胱甘肽過氧化物酶：谷胱甘肽過氧化物酶是一種廣泛存在的過氧化物分解酶，能夠催化谷胱甘肽向氧化型谷胱甘肽的轉化，將有毒的過氧化物轉化為無毒代謝物，從而發揮保護作用。

二、Nrf2通路在間質性膀胱炎中的研究進展

1.Nrf2在間質性膀胱炎中的表達：間質性膀胱炎的獨特之處在于其不適用于感染性或非感染性膀胱炎的經典區分，全球范圍內定義及診斷標準仍存在巨大差異，目前IC的臨床診斷主要是通過病史采集及體格檢查，膀胱鏡下水擴張和膀胱黏膜活組織檢查，排除其他疾病如膀胱癌、腺性膀胱炎等。部分IC患者膀胱鏡下可見膀胱黏膜出現小球樣出血，僅10%左右的患者會出現典型的Hunner潰瘍。這種排他性診斷并不準確且容易誤診，治療方式也十分有限。一項隨機對照實驗納入了16例女性IC患者及25例健康女性，分析并比較發現IC組中氧化應激損傷明顯上調，相關氧化應激損傷指標單獨使用并無特異性，聯合使用可以作為IC診斷中的標志物[8]。在IC的相關研究中，發現氧化應激反應及炎性介質的作用貫穿疾病整個發展過程，Nrf2通路被認為在該疾病發生、發展過程中起著關鍵作用。

目前最有說服力的理論學說描述了糖胺聚糖層的破壞和功能障礙，導致尿路上皮損傷，繼而引起炎性介質浸潤及氧化應激損傷，同時激活了Nrf2通路的表達，多種動物研究模型根據該理論學說建立，如環磷酰胺(cyclophosphamide, CYP)腹腔注射，脂多糖膀胱內灌注等。Mbanefo等[9]對CYP誘導的小鼠IC模型膀胱進行了組織學檢測及轉錄譜分析，研究發現，經CYP處理后小鼠膀胱表現出明顯炎性水腫，轉錄譜分析顯示上調了一系列促炎基因表達，如IL-1β、TNF-α和IL-6等，更強調了Nrf2通路下游抗氧化基因HO-1的轉錄上調。使用魚精蛋白/脂多糖小鼠膀胱內灌注后可誘導出類似IC排尿行為的改變、組織學的損傷以及各類氧化應激指標的升高，并檢測到Nrf2通路下游抗氧化基因表達明顯上升[10]。由此可見，Nrf2通路是IC的發生、發展過程中重要的調控靶點，基于Nrf2通路的相關研究對于IC的早期診斷、臨床治療及改善預后具有重大意義。

2.Nrf2通路相關治療手段在IC中的研究進展

(1)激活Nrf2通路的天然抗氧化化合物：目前針對Nrf2通路的治療藥物富馬酸二甲酯已被FDA批準用于治療多發性硬化癥，同樣有大量研究在探索是否有相關藥物可應用于IC。Core等[11]研究發現,紫花苜蓿中的活性成分百里香醌(thymoquinone)劑量依賴性地保護了小鼠膀胱組織學改變，抑制炎性細胞因子的釋放，并在小鼠膀胱組織內檢測到Nrf2通路相關抗氧化基因的表達上調及氧化應激指標的降低。其他類似化合物在日常生活中也不難獲取，如叔丁基對羥基茴香醚、萊菔硫烷(sulforaphane, SFN)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)、蘋果汁、姜黃素等，這些天然化合物能夠通過誘導激活Nrf2及其下游靶基因的表達，抑制氧化應激及炎性介質，對于IC的預防治療極具研究意義及研發前景。

(2)褪黑素：在CYP誘導的膀胱炎模型中用蘇木精和曙紅染色對膀胱的組織學鏡下觀察可以發現廣泛的膀胱炎，黏膜下層有明顯的白細胞浸潤。相反，在褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基色胺)治療的膀胱中，尿道上皮保存良好且炎癥改變得到緩解[12]。褪黑素是一種主要由哺乳動物的松果體分泌的神經激素，廣泛分布于人體器官中。褪黑素的生物學功能被廣泛研究，作為一個強大有效的抗氧化劑，可以清除不同類型的氧自由基并激活抗氧化劑防御功能，其中涉及多個通路，如NF-κB、Nrf2、MAPK通路等[13]。Tripathi等[14]研究發現，褪黑素治療IC小鼠可增加膀胱組織中Nrf2及下游抗氧化基因的表達，抑制氧化應激反應及炎性介質分泌，從而減少膀胱損傷和細胞凋亡。進一步研究發現，褪黑素還可以改善膀胱過度活動等LUTS癥狀，并通過褪黑素受體激動劑對照實驗發現褪黑素改善膀胱功能主要是由于其抗氧化及抗炎特性[15]。因此，褪黑素由于其卓越的抗氧化能力且安全可靠，對于IC的預防及治療具有指導意義，但目前尚缺乏相關循證醫學證據。

(3)單克隆抗體：血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)是一種促進血管生成的多效細胞因子。研究表明，VEGF在IC患者尿液中高表達且與膀胱疼痛嚴重程度相關，可作為臨床診斷IC的尿液生物學標志物[16]。同時在IC模型小鼠的膀胱中也檢測到VEGF的表達上調，其機制可能與炎性介質的激活、趨化因子活化以及巨噬細胞募集增加相關。研究發現，抗VEGF中和抗體應用于IC小鼠模型可改善疼痛導致的骨盆超敏，但對排尿行為無明顯作用，而阻斷VEGF/VEGF受體2信號轉導可改善IC相關膀胱功能障礙[17，18]。其中相關具體機制尚不明確，有研究發現，VEGF可通過ERK1/2信號通路激活Nrf2通路，進而上調其自身表達，同時Nrf2也可以通過Nrf2/HO-1/HIF-1α途徑上調VEGF的表達，促進異常血管生成， 這可能部分解釋了以上研究結果。目前單克隆抗體在IC治療中的應用研究甚少，相關具體機制仍需進一步探索，但其為IC治療提供了新的思路。

(4)干細胞療法：尿路上皮功能障礙是IC相關致病性的關鍵因素之一，而干細胞具有自我更新、增殖和分化為各種細胞類型的能力，包括尿路上皮和平滑肌細胞，因此干細胞療法被視為治療IC的最新策略。同樣的，在正常干細胞中，Nrf2誘導抗氧化劑基因使細胞內ROS保持在較低水平，以抑制干細胞的過度增殖。人臍帶血干細胞可以顯著改善IC大鼠的排尿頻率，組織學分析顯示，可治愈IC的大多數病理特征，包括尿路上皮剝奪和肥大細胞浸潤，神經網絡和受損膀胱黏膜中的血管生成。同樣的，人間充質干細胞在大鼠IC模型中已獲得成功進展，Chen等[19]研究證明,聯合使用脂肪來源的間充質干細胞和褪黑素可明顯改善IC癥狀。實驗發現，聯合療法顯著下調了膀胱組織中炎性標志物以及ROS相關蛋白的表達水平，同時激活了Nrf2通路上調了抗氧化蛋白HO-1及NQO1的表達。此外，尿源性干細胞(USC)更容易獲得，抗炎作用明顯優于其他干細胞，且具有完整的干細胞特性,更有改善膀胱功能障礙的潛力，因此被視為治療IC的最佳干細胞來源[20]。Li等[10]將USC應用于IC大鼠模型中發現，膀胱組織中Nrf2通路下游抗氧化蛋白HO-1及NQO1明顯上調，并下調了凋亡、氧化應激、自噬相關標志物，從而改善膀胱內環境，發揮保護IC逼尿肌細胞的作用。總之，干細胞療法既依賴于Nrf2誘導的低ROS環境，又能在IC中通過激活上調Nrf2通路及其下游抗氧化基因表達，為IC的再生治療提供新的方案。

三、展 望

綜上所述，Nrf2通路在IC中可通過上調下游抗氧化基因表達，從而抑制氧化應激損傷，改善膀胱功能。盡管近年來人們對IC的認識已經取得較大進步，但仍缺乏早期診斷、有效治療和改善預后的相關手段，因此Nrf2通路對于IC的病理生理及治療手段的研究具有重要意義，但因缺乏客觀的功能評價體系，尚無法對IC動物模型的功能性活動進行量化評價，相關具體機制及治療作用仍需進一步探索。本文回顧并討論了Nrf2通路的概念和功能，并綜述了其在間質性膀胱炎中的研究進展，希望有助于以Nrf2通路為方向的臨床應用研究。