外泌體在肝細胞性肝癌中的作用研究進展

劉興暉 彭婷瑋 楊 蘭

肝細胞性肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是原發性肝癌中最常見的類型，具有發生率高、病死率高的特征[1]。HCC起病隱匿，并且缺乏敏感、特異的早期診斷方法，故常常漏診。其次，HCC的高轉移特性加速了疾病進展。目前針對HCC的治療包括手術切除和放化療干預(如索拉菲尼、射頻消融術)，前者針對早期HCC患者，可以適當延長患者生存期，但HCC肝內復發和肝外轉移的發生率較高。后者針對晚期HCC患者，但容易誘導肝癌細胞產生耐藥性。因此，兩種治療方案的預后均不樂觀。為了明確HCC的早期診斷、監測疾病的進展、評估預后及治療方法的療效，發現一些敏感而特異的HCC標志物是很重要的。大量研究表明,外泌體表面的膜結合分子，可被受體細胞識別并廣泛參與細胞間的信息傳遞，參與腫瘤微環境的調節，包括腫瘤發生、轉移及血管生成、免疫調節等過程[2, 3]。同時外泌體也會影響HCC的預后及治療。

一、外泌體的生物學特性

活細胞可以通過分泌胞外囊泡(extracellular vesicles,EV)與鄰旁細胞或遠端細胞進行信息交流。EV根據亞細胞來源分為兩大類：一類是細胞質膜直接出芽形成、釋放直徑為100～1000nm的微囊泡;另一類是活細胞內多囊泡體(MVB)與細胞質膜融合后釋放出一系列小囊泡，即外泌體(exosomes)，其直徑為50～150nm[4]。

細胞質膜向內凹陷，在RAB5和RAB3介導下細胞質膜向內凹陷形成早期內體，進一步發育成熟形成晚期內體，在轉運所需的內體分選復合體(ESCRT)的作用下向內側出芽，形成包裹多個腔內小泡(IVB)的多囊泡體(MVB)。當MVB與細胞質膜融合后，腔內囊泡釋放至細胞外，形成外泌體。幾乎所有細胞都能分泌外泌體。腫瘤細胞來源的外泌體(tumor-derived exosome,TDE)攜帶一系列信號分子，包括蛋白質(膜蛋白、黏附蛋白、轉錄因子等)、核酸(DNA、mRNA、非編碼RNA)和脂質(鞘磷脂、神經酰胺、膽固醇)[5]。

外泌體的分離方法較多，目前的金標準為差速超速離心法，還有一些其他方法如微流控技術、免疫親和層析等。外泌體的鑒定方法有電鏡下觀察形態、粒徑分析判斷其粒子大小以及蛋白質印跡法檢測特異性蛋白的表達[6]。

二、外泌體與肝癌

1.外泌體與肝癌的診斷：近年來，由于外泌體攜帶的生物分子與來源細胞具有一致性， TDE作為腫瘤分子標志物在腫瘤診治中的應用得到了越來越多的關注。研究發現，與健康對照組比較，HCC患者血清中有19種miRNAs顯著增加。其中，miR-210分泌由HCC細胞來源的外泌體介導，因此，miR-210也可作為HCC診斷的生物學標志物之一[7]。Pu等[8]研究發現， HCC患者血清中外泌體has-miR-21-5p和has-miR-144-3p表達水平顯著高于慢性乙型肝炎(CHB)患者，ROC曲線顯示，兩者在HCC診斷上的表現優于甲胎蛋白，敏感度和特異性更高，作為腫瘤分子標志物具有良好的臨床應用前景。

2.外泌體與肝癌的發生和發展：腫瘤微環境是由腫瘤細胞、血管內皮細胞、成纖維細胞、抗原遞呈細胞以及細胞外基質、生長因子、炎性細胞因子等組成。不同細胞外泌體通過攜帶不同信號分子發揮細胞通訊作用，參與肝癌的發生、轉移、血管生成以及免疫抑制型微環境構建。

(1)腫瘤發生：當癌基因表達過度活化或抑癌基因表達過度受抑時，細胞表現為增殖能力的過度增強和凋亡能力的過度削弱，進而導致腫瘤的發生。PTEN是一種抑癌基因，負向調控腫瘤的發生。有研究表明，肝癌細胞外泌體miR-155抑制鄰旁或遠端受體HCC細胞中PTEN表達，活化PI3K/AKt信號通路以促進HCC細胞的增殖[9]。Zhang等[10]研究發現，HCC患者血清中脂肪細胞來源外泌體circDB表達水平上調，通過與HCC細胞中miR-34a結合，上調去泛素相關分子USP7的表達，通過減少細胞增殖過程中的DNA損傷來促進腫瘤發生。Mao等[11]在研究中提到了癌癥相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblasts, CAFs)調節HCC細胞增殖。轉移性肝癌細胞來源EV中的NID1通過激活肺臟中的CAFs，促進其旁分泌腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)，進而誘導HCC細胞克隆的形成，表現出更加活躍的增殖能力。

(2)腫瘤轉移：腫瘤轉移是HCC發展過程中的關鍵環節，常常提示疾病朝著不良方向進展。外泌體中的信號分子通過細胞間信號交流介導上皮間質轉化、血管滲漏等生物學過程，促進HCC的侵襲與肝外轉移[3]。

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymale transition,EMT)是指腫瘤細胞在CAFs的影響下從上皮表型轉化為間質表型，功能上體現為低增殖活性、高侵襲與遷移能力，形態上由上皮細胞的立方形、圓形轉變為間質細胞的梭形、星形，細胞分子上體現為失去上皮表型標志(如鈣黏蛋白)，獲得間質表型標志(如α-SMA)[3]。Zhu等[12]研究發現，HCC細胞外泌體中circ-0004277表達水平上調，通過細胞通訊作用，提高癌旁正常肝細胞中circ-0004277的表達水平，進而誘導細胞發生EMT，促進HCC的肝內轉移。Fang等[13]研究發現，肝癌細胞外泌體中高表達的miR-1247-3p進入肝成纖維細胞后，通過結合胞內B4GALT3抑制其表達，促進NF-κB磷酸化，成纖維細胞產生更多的IL-1β、IL-6和 IL-8等促炎性細胞因子，進而被活化為CAFs，促進腫瘤細胞發生EMT，侵襲力增加。

腫瘤細胞穿透血管內皮屏障在腫瘤轉移中發揮關鍵作用。當血管通透性增強時，肝臟中的HCC細胞可穿過血管壁，進入血液循環中，隨血流轉移至全身各處，在適宜的靶器官中定植，形成肝外轉移灶。血管內皮細胞能夠攝取HCC細胞外泌體miR-103，通過抑制VE-鈣黏蛋白、p120連接素和閉鎖連接蛋白1合成，削弱內皮細胞間黏附連接與緊密連接的完整性，增加血管通透性，促進HCC細胞血管滲漏與侵襲轉移[14]。除了削弱血管間的黏附作用以外，促進血管內皮細胞與HCC細胞間的黏附也能夠介導HCC的高轉移特性。細胞間黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1,ICAM-1)是一種能夠顯著增強內皮細胞與腫瘤細胞黏附作用的分子，CD90+Huh7細胞外泌體lncRNA H19上調內皮細胞ICAM-1表達，使得內皮細胞黏附更多CD90+Huh7細胞，以利于HCC細胞穿過內皮侵襲轉移[15]。

(3)血管生成：新血管生成不僅能為腫瘤提供大量的氧氣和營養，促進腫瘤的生長，還作為轉移細胞進入體循環的入口點，介導腫瘤侵襲轉移能力的增強。Lin等[7]研究發現HCC患者微血管密度與血漿miR-210表達水平具有明顯相關性。研究發現，當肝癌細胞來源的外泌體miR-210與單層內皮細胞共孵育后， HCC細胞來源外泌體miR-210通過下調SMAD4和STAT6蛋白表達來促進毛細血管生成。腫瘤干細胞樣CD90+肝癌細胞通過外泌體高水平表達lncRNA H19，顯著增加促血管生成因子VEGF和相應受體VEGF-R1的釋放，也能上調促血管生成作用[15]。Shao等[16]研究發現，HCC細胞來源EVs的miR-584-5p通過結合磷酸烯醇式丙酮酸激酶1(PCK1)抑制其活性，誘導核因子E2相關因子2(Nrf2)活化，上調血管內皮生長因子A(VEGFA)表達，促進內皮細胞增殖，增強血管生成能力。Wang等[17]認為，HCC細胞來源的外泌體中miR-1290富集，當其被血管內皮細胞內化后，能夠抑制胞內SMEK1的表達，削弱其對VEGFR2磷酸化的抑制作用，從而誘導VEGFR2的活化和血管生成。除了非編碼RNA介導血管生成外，蛋白質分子也可參與其中。血管緊張素轉運蛋白(vasorin，VASN)是一種Ⅰ型跨膜蛋白，在腫瘤發生和血管生成中發揮重要作用。Huang等[18]研究發現，HepG2細胞外泌體高表達VASN，被受體HUVEC內化攝取后，內皮細胞的增殖能力增強，大量的內皮細胞聚集有利于血管生成。

(4)免疫調節：正常情況下，機體能夠通過抗腫瘤免疫來清除體內癌細胞，但在腫瘤進展過程中，腫瘤免疫微環境由激活轉為抑制，腫瘤細胞逃避機體的免疫破壞作用。巨噬細胞作為腫瘤免疫微環境中一類重要的免疫細胞，通過其表面配體與T細胞表面受體相互作用，介導腫瘤免疫抑制型微環境的形成。Tan等[19]研究發現，肝癌細胞外泌體中表達LOXL4蛋白質分子，并且能被骨髓來源的巨噬細胞(BMDM)內化攝取，在BMDM成熟早期促進其向CD11b+F4/80+腫瘤相關巨噬細胞群(TAM)分化，銅依賴的H2O2產生通過激活IFN相關的信號通路，誘導STAT3和STAT1活化，增強TAM表面PD-L1分子的表達，巨噬細胞可通過PD-L1和CD86等細胞表面抗原與細胞毒性T細胞相互作用，抑制T細胞的活化，并促進TIM3陽性的CD4+和CD8+T細胞的耗竭，導致腫瘤免疫逃逸。根據活化方式不同巨噬細胞分為兩種類型，一類是具有抗炎抗腫瘤活性的M1型，另一類是誘導機體產生免疫抑制，腫瘤細胞逃避免疫系統的殺傷破壞作用得以生存的M2型[20]。有研究表明，肝癌細胞來源外泌體中高表達lncRNA TUC339，被巨噬細胞內化攝取后，降低巨噬細胞產生IL-4等促炎性細胞因子的能力，吞噬作用減弱，介導巨噬細胞M2極化，促進HCC進展[21]。

3.外泌體與肝癌預后：HCC早期患者可進行肝切除術治療，外泌體一些信號分子的表達與術后復發時間、總生存期長短、轉移潛能等密切相關，可作為評估預后的指標。Wang等[22]跟蹤隨訪183例行肝細胞癌切除術后的丙型肝炎病毒相關肝細胞性肝癌患者10年發現，這些患者血清外泌體中的分化拮抗非蛋白質編碼RNA(differentiation antagonizing non-protein coding RNA，DANCR)的表達水平與HCC復發呈正相關，并且成為HCC復發和病死率相關的最具預測性的因素。另外一項研究發現，HCC患者外泌體miR-103表達與HCC的轉移潛能和復發風險呈正相關，外泌體中miR-103水平高表達提示預后較差[14]。Jung等[23]檢測并分析14例HCC患者(其中8例患者1年內沒有發生腫瘤轉移，6例患者發生腫瘤轉移)血清外泌體的miRNA表達譜后發現，有61種miRNA在轉移性HCC患者血清外泌體中表達顯著上調，提示HCC的不良預后。

4.外泌體與肝癌治療

(1)免疫治療：樹突狀細胞(DC)因其具有極強的抗原遞呈作用和激活抗腫瘤免疫的能力而越來越廣泛地應用于HCC免疫療法中，其誘導的腫瘤免疫強度很大程度上取決于腫瘤抗原的含量及特性，外泌體因其具有選擇性富集來源細胞胞內成分的作用，故與腫瘤細胞碎片比較，腫瘤來源外泌體(TDE)作為抗原誘導DC活化的能力和腫瘤免疫強度更強。研究表明，HCC細胞衍生的外泌體中特征性肝癌抗原AFP和分子伴侶蛋白Hsp70顯著增加，在體外能夠被DC細胞內化攝取并促進DC細胞的成熟與活化，進一步放大TDE引發的免疫反應。同時，將TDE活化的DC細胞注入小鼠血清中發現，CD3+CD8+細胞毒性T細胞顯著增多，CD25+FoxP3+CD4+調節性T細胞顯著減少，產生免疫抑制性因子IL-10、TGF-β濃度顯著降低，免疫活化性因子IFN-γ濃度顯著升高，腫瘤免疫微環境得到了顯著改善，由免疫抑制轉變為免疫活化，為抗腫瘤免疫效應提供有利的環境條件[24]。

(2)作為藥物運送載體：外泌體因其具有低免疫原性、低毒性、可進行人工修飾，并且能夠自由穿過生物屏障的特點，是非常理想的藥物輸送載體。外泌體既可以包裹HCC化療藥物，通過外層脂質膜保護作用使其不容易被降解，延長其在機體內作用時間，也可以包裹提高HCC細胞對化療藥物敏感度的miRNA等，利于化療藥物在機體內發揮抑瘤作用。Zhang等[25]將阿霉素或索拉菲尼裝載至紅細胞來源的EVs中，該載藥EVs可明顯抑制小鼠原位肝癌細胞的生長,并且其對肝癌的抑制作用強于傳統化療藥物給藥方式及劑量所誘導的肝癌抑制作用。miR-122表達下調可激活IGF-1R進而活化RAS/RAF/ERK信號轉導途徑，介導HCC細胞對索拉菲尼耐藥性的形成，過表達miR-122時可使得HCC細胞對索拉菲尼敏感而誘導細胞凋亡[26]。Lou等[27]在研究中用編碼miR-122的質粒轉染脂肪間充質干細胞(AMSC)后，產生的外泌體可通過分泌miR-122增加HCC細胞對索拉菲尼的敏感度。此外，外泌體還能夠通過包裹抑制腫瘤細胞生長和侵襲的miRNA，使其轉移到HCC細胞后逆轉其惡性表型。人肝成纖維細胞miR-335-5p表達上調可抑制鄰旁HCC細胞增殖，進而抑制腫瘤生成，CAFs外泌體分泌的miR-320a可作為一種抗腫瘤miRNA，與其下游靶點PBX3結合，抑制肝癌細胞的增殖、遷移[28，29]。因此，選擇合適的外泌體裝載這些miRNA，為HCC的靶向治療提供了新的途徑。

三、展 望

綜上所述，不同細胞來源的外泌體攜帶不同的信號分子，通過靶向不同的受體或介導不同的信號轉導通路參與HCC的發生、發展、轉移和復發等，包括腫瘤發生、轉移及血管生成和免疫調節，因此，通過對患者體液中外泌體蛋白質、非編碼RNA等分子的檢測和分析能夠為癌癥的早期診斷、預后評估和治療方法的改善提供一定的參考和依據。但由于目前的外泌體分離方法無法獲得完全純化的外泌體，所以限制了外泌體作為HCC分子標志物的臨床應用。今后應進一步研究外泌體的特性，以利于將外泌體與大小相近的凋亡小體和微囊泡區分開來。此外，目前外泌體攜帶信號分子通過細胞通訊介導HCC發生、發展的機制已經得到了充分研究，但外泌體的生成過程同樣具有致瘤作用，因此，今后應致力于研究外泌體的生成在HCC的發生、發展中發揮的作用，使得HCC診斷的分子標志物與治療途徑更多樣。