基于同位素相對標記與絕對定量技術結合質譜技術的幼年特發性關節炎血清蛋白質組學研究

劉琴 孫紅 余東陽 胡紅兵

華中科技大學同濟學院附屬武漢兒童醫院1輸血科，3檢驗科（武漢 430015）；2浙江省立同德醫院檢驗科（杭州 310012）

幼年特發性關節炎（juvenile idiopathic arthritis，JIA）是兒童常見的以慢性關節滑膜炎為特征的一類自身免疫性疾病，其主要表現為腫脹、疼痛和活動受限，并可導致嚴重的并發癥，JIA 反復發作還會延緩生長發育，甚至致殘，后果嚴重［1-3］。目前，該疾病病因不明，并且缺乏與JIA 相關的生物指標物，臨床診斷JIA 主要依靠臨床資料，不利于疾病的早期診斷和治療。生物質譜技術作為蛋白質組學研究的新型技術，有利于探明疾病的發病機制，尋找新的疾病診斷與治療的指標［4］。本研究利用相對和絕對定量的同位素標記（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）聯合nano LC-MS/MS 質譜技術，對JIA 患者血清中的蛋白質進行鑒定分析，以期尋找新的JIA 診斷的血清標志物，為臨床治療及疾病療效監測提供線索。

1 資料和方法

1.1 一般資料收集武漢兒童醫院2017年11月至2018年1月JIA 患者18 例，患者診斷參照2001年國際風濕病學聯盟（ILAR）的分類標準討論稿，年齡3.2 ～13.7 歲，中位年齡7.5 歲，其中男10 例，女8 例。正常對照組20 例，年齡3.4 ～15.1 歲，中位年齡8.1 歲，其中男10 例，女10 例，為同期武漢兒童醫院健康體檢者，查體無異常，同時排除肝、腎功能損害、腫瘤、自身免疫性疾病、感染及傳染病。收集浙江省立同德醫院2017年8月-2018年1月RA 患者44 例，患者診斷參照2010年歐洲抗風濕病聯盟（EULAR）聯合美國風濕病學會（ACR）發布的RA 診斷標準，年齡35.2 ～70.7 歲，中位年齡47.5 歲，其中男17 例，女27 例。本研究經武漢兒童醫院醫學倫理管理委員會批準。

1.2 主要試劑和儀器血清高豐度蛋清去除試劑盒（SIGMA，批號：PROTBA-1KT）；BCA 蛋白水平測定試劑盒（碧云天生物，批號：P0010S）；RIPA強裂解液（碧云天生物，批號：P0013B）；iTRAQ 試劑盒（ABSciex 公司，批號：4381664）；蛋白酶抑制劑（PMSF）（凱基生物，批號：KGP610）。質譜儀（Thermo Scientific Q Exactive）；液相色譜儀（島津LC-20AD）；二維液相色譜儀（Thermo Dionex Ultimate 3000 RSLC nano）。

1.3 方法

1.3.1 標本采集收集研究對象100 μL 血清標本，-80 ℃保存備用。

1.3.2 樣本處理去除血清中的高豐度蛋白；測定蛋白質含量；測定后的樣本進行酶解；分別用iTRAQ 試劑114、116 和115 進行標記；混合，真空干燥。以上操作按照各個試劑盒說明書進行。

1.3.3 質譜分析將標記后的多肽混勻進行液相分離，色譜柱流動相A：pH 10，20 mmol/L 甲酸胺；流動相B：pH 10，20 mmol/L 甲酸胺，80%ACN；紫外檢測波長為214 nm/280 nm；流速為200 μL/min。分離后的肽段進入質譜儀進行檢測，一級質譜參數：AGC target：3e6；Maximum IT：40 ms；Resolution：70 000；Scan range：350 to 1 800 m/z。二級質譜參數：AGC target：1e5；Maximum IT：60 ms；Resolution：17 500；TopN：20；NCE/stepped NCE：30。

1.3.4 生物信息學分析將質譜數據轉化為，mfg 文件，利用Protein PilotTMSoftware 4.5 軟件進行檢索，檢索參數如下：Sample Type：iTRAQ 8plex（Peptide Labeled）；Cys alkylation：MMTS；ID focus：biological modificaition；Digestion：typsin；Database：homo.fasta；Serch effort：thorough ID；FDR Analysis：Yes；User Modified Parameter Files：No。以差異倍數＞1.30 或＜0.77，P＜0.05 定義為差異蛋白。利用UniProt 數據庫（http：//www.uniprot.org/proteomes/）中人物種蛋白序列進行GO 注釋，并基于GO 的細胞組分（CC）、分子功能（MF）和生物學過程（BP）對差異表達蛋白質進行富集分析。分別利于KEGG數 據 庫（http：//www.Kegg.jp/kegg/pathway.html）和STRING 數據 庫（http：//string-db.org/cgi/）進行生物學通路富集分析和蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析。

2 結果

2.1 質譜鑒定分析結果JIA 組相對于健康體檢組，共鑒定差異蛋白106 個，其中49 個表達上調，57 個表達下調（圖1）。JIA 組相對于RA 組，共鑒定差異蛋白56 個，其中33 個表達上調，23 個表達下調。相對于健康體檢組，JIA 組和RA 組均差異表達的蛋白有63 個，其中26 個表達上調，37 個表達下調。由此可見，JIA 和RA 的疾病機理既具有相似之處，又存在較大差異。

圖1 差異表達蛋白熱圖Fig.1 The heat map of differential protein

2.2 GO 富集分析JIA 組相對于健康體檢組，GO富集分析差異蛋白主要參與的生物學過程、細胞定位和分子功能（圖2）。這些差異蛋白參與的生物學過程主要有：血小板脫顆粒、急性炎癥反應、血液凝固、纖溶、脂質轉運等。這些差異蛋白質主要定位在血漿脂蛋白顆粒、血小板α 顆粒、高密度脂蛋白顆粒、血小板致密性顆粒管腔等、脂蛋白復合物。這些差異蛋白參與的分子功能主要包括絲氨酸型內肽酶抑制活性、氧載體活性、免疫球蛋白結合、珠蛋白結合、脂蛋白顆粒受體結合等。由此可見，JIA 的發病機制與血液凝溶系統、脂質代謝、免疫系統密切相關。

圖2 GO 富集分析圖Fig.2 The gene ontology（GO）analysis

2.3 KEGG 通路分析JIA 組相對于健康體檢組，KEGG 通路分析結果：補體和凝血級聯反應、PPAR信號通路、瘧疾、膽固醇代謝、血小板活化、鐵凋亡、造血細胞系、系統性紅斑狼瘡、ECM-受體相互作用、NF-κB 信號通路等10 條差異蛋白富集通路。表明脂質代謝、血液凝溶系統、免疫系統參與JIA疾病的發生發展（圖3）。

圖3 KEGG 通路分析圖Fig.3 The KEGG pathway analysis

2.4 蛋白-蛋白相互作用STRING 網絡分析JIA組相對于健康體檢組，通過STRING 網絡分析發現脂聯素、APOH、AHSG 等差異蛋白可與其他多個差異蛋白發生相互作用，是PPI 網絡的關鍵性節點，可作為研究JIA 機制的候選蛋白（圖4）。

圖4 STRING 蛋白-蛋白相互作用網絡（PIP）分析圖Fig.4 The STRING analysisof protein-protein interaction network（PIP）

3 討論

蛋白質組學（protcomics）是以蛋白質組為研究對象，采用各種實驗技術手段來探索蛋白質表達、定位與功能，以及細胞的活動規律的一門新興學科［5-6］。iTRAQ 聯合質譜是具有高靈敏度和重現性的蛋白質組學定量技術，是研究組織、細胞等在不同生理病理狀態下，不同病理類型中差異蛋白的一種有效方式，已廣泛應用于腫瘤、炎癥、免疫性疾病中［7-9］。既往蛋白質組學研究主要針對成人關節炎，對兒童關節炎研究甚少，所用的分析技術主要是傳統的雙向凝膠電泳，靈敏度、重復性與質譜技術相對較差［10-13］。然而，JIA 與成人類風濕關節炎的發病機理有很大的區別，需要更多的蛋白質組分析數據［14-15］。

本研究利用iTRAQ 結合質譜技術，對JIA 患者和健康人群血清中的蛋白質進行鑒定和相對定量分析比較，共篩選出差異蛋白106 個。通過GO 富集分析和KEGG 通路分析結果表明，血液凝溶系統、免疫系統、脂質代謝與JIA 的發病機制密切相關。并通過STRING 分析篩選出在PPI 網絡中起關鍵作用蛋白：脂聯素、AHSG、APOH 等，作為進一步深入研究JIA 機制的候選蛋白。通過分別比較JIA 組和RA 組與健康體檢組的差異蛋白，發現有26 個差異蛋白均呈現上調，37 個差異蛋白均呈現下調。鑒于這兩類疾病的特征均為慢性關節滑膜炎，在蛋白組學上也具有較大的相似之處也不足為奇。此外，本研究還比較了JIA 患者和RA 患者血清中的差異蛋白，共鑒定篩選出56 個差異蛋白。由此可見，JIA 與RA 兩種疾病之間還存在較大區別，JIA 患兒不是RA 患者的縮小版，JIA 疾病有其特有的發病機制。

本研究發現ADIPOQ 基因編碼的脂聯素（adiponectin）在JIA樣本中高表達。通過STRING分析，它與其他多個差異蛋白相互作用，是PPI 網絡的關鍵節點。脂聯素是由脂肪細胞分泌的一種激素蛋白，可以通過與單核細胞和淋巴細胞脂聯素受體結合發揮調節免疫炎癥反應的作用［16-17］。研究表明，脂聯素在類風濕關節炎患者的血清中高表達，并與關節破壞程度正相關［18-19］。在JIA 中脂聯素水平如何變化，目前尚未有文獻報道，脂聯素是否可以成為JIA 的生物標志物仍需進一步驗證。

此外，近年來研究表明血脂紊亂也存在于兒童風濕性疾病患者中，并與早期動脈粥樣硬化形成相關［20］。孫東明等［21］研究顯示，全身型相較于其他亞型JIA，更易出現血脂代謝紊亂。在本研究中，GO 富集分析和KEGG 通路分析結果表明差異表達蛋白質與脂質代謝相關信號通路密切相關。通過STRING 分析發現，與脂質代謝相關的APOH、APOA2、APOC3 等蛋白在PPI 網絡中起到關鍵作用，是研究JIA 機制的候選蛋白。由此可見，脂質代謝可能成為JIA 發病機制研究的新的突破點。通過調節脂質代謝通路，改善患兒的脂質代謝狀態可能成為治療該疾病的新方向。

總之，本研究通過比較、分析JIA 患者與正常個體以及成人RA 患者的蛋白質組的差異，分析差異蛋白的功能、定位、相互作用關系等特性，不僅有助于探討JIA 發病機制，發現新的生物指標，還可為JIA 治療提供新的思路，為臨床藥物的開發提供重要線索。但由于本研究樣本量較少，可能存在一定的誤差，需進一步加大樣本量，并對鑒定的差異蛋白進行驗證。