米諾環素抑制5-脂氧合酶對未控制失血性休克大鼠肝組織的保護作用

鄭強 溫天明 舒其琛 楊虎 翟祥龍 劉世平

1成都市第一人民醫院急診科（成都 610000）；2川北醫學院附屬醫院急診科（四川南充 637000）

米諾環素（Minocycline，MC）是一種半合成的第二代四環素衍生物，它除了良好的抗菌作用外，還具有抗炎、抗凋亡、抑制基質金屬蛋白酶、清除氧自由基、免疫抑制等其它作用，在多種臟器缺血再灌注損傷中發揮了組織細胞保護作用，減輕了組織缺血再灌注損傷［1］。已有研究表明在失血性休克大鼠模型中用MC 可明顯減輕休克引起的細胞壞死、凋亡與氧化應激等，但具體機制不完全清楚［1］。有研究發現MC 可抑制5-脂氧合酶（5-LOX）的表達及其活性、進而抑制LTs、LTB4 等的生成，減輕中性粒細胞浸潤［2］。而使用抑制5-LOX 抑制劑MK-886 可減少缺血再灌注后內臟器官損傷［3］。據此推測MC 可通過抑制5-LOX 的表達，抑制炎癥反應，從而發揮臟器保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物分組及SD 大鼠失血性休克模型的制備動物分組：選用250 ～300 g 的SD 大鼠（由川北醫學院動物實驗中心提供），使用1%戊巴比妥鈉35 mg/kg 腹腔內注射麻醉，固定，碘伏消毒，外科手術分離右股動、靜脈并置管，股動脈連接三通管后接壓力轉換器（Pclab-530C 生物醫學信號采集系統）、計算機行持續血流動力學監測和抽血，股靜脈用于輸液。置管成功后分為：假手術組（空白組）10 只：僅作置管觀察。液體復蘇組（對照組）10只：復蘇時靜脈給予相應的生理鹽水。MK-886 組（實驗組1）：復蘇時靜脈給予MK-886（使用DSMO溶解后生理鹽水稀釋）1.2 mg/kg。米諾環素組（實驗組2）10 只：復蘇時靜脈給予米諾環素20 mg/kg。

未控制失血性休克模型的制備［1］分為4 期：（1）未控制創傷性失血性休克模型建立：模擬院前急救人員到達之前期（0 ～0.5 h），使MAP 控制在30 ～35 mmHg：通過股動脈導管抽取血液及斷尾復制未控制休克大鼠模型。（2）止血前液體復蘇期：模擬院前急救期（0.5 ～1.5 h）：通過股靜脈通道給予上述藥物后以乳酸林格氏液進行液體復蘇，同時予以斷尾失血，使MAP 控制在50 ～60 mmHg。（3）止血及液體復蘇期：模擬院內救治期（1.5 ～3.5 h［2］）：予以手術止血、血液回輸及乳酸林格氏液復蘇，目標MAP ≥80 mmHg。（4）標本收集（3.5 ～24 h）：拔出動靜脈置管，放回鼠籠，自由飲食，24 h 后采集血液標本后處死采集肝臟組織。

1.2 標本處理與指標檢測

1.2.1 數據與標本收集（1）死亡率；（2）0-0.5 h失血量；斷尾失血量（5 mL 燒杯測量）；（3）平均動脈壓（MAP）、心率（HR）：0、0.5、1.5、2.5、3.5 h（Pclab-530C 生物醫學信號采集系統）采集；（4）0.5 ～1.5 h 輸液量（微量輸液泵輸入）；（5）Elisa 法檢測血3.5 h TNF-α、IL-6、肝組織LTs、LTB4 和5-LOX；（6）肝組織一部分用10%甲醛溶液固定，石蠟包埋后備病理組織學檢查，另一部分制成勻漿，用比色法檢測丙二醛（MDA）、TBA 法檢測髓過氧化物酶（MPO）分析；（7）全自動生化分析儀（日立7600 型）檢測血3.5 h 谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）水平。

1.2.2 TNF-α、IL-6、ALT、AST 的檢測標本檢測均為抽取SD 大鼠1 mL 全血后分離血清獲得。取一部分定量肝組織碾磨并生理鹽水定量稀釋后測定MDA、MPO、LTs、LTB4 和5-LOX。取小塊肝組織，于10%甲醛溶液中固定24 h，逐級乙醇脫水、二甲苯浸泡、浸蠟、石蠟包埋、切片、附貼、HE 染色后由我院病理科2 位有經驗的病理學醫生采用雙盲法對每個標本進行分析。注：米諾環素、MK-886、IL-6、MPO、LTs、LTB4 和5-LOX 試劑盒購自武漢六合生物技術有限公司；MDA 試劑盒購自南京建成科技有限公司；ALT、AST 試劑盒購自四川邁克科技有限公司。以上標本的檢測均按照操作說明書進行并嚴格遵守各實驗室標準操作規程。

1.3 肝缺血再灌注損傷的Suzuki′s 病理學評分標準見表1。

表1 IRI 的Suzuki′s 病理學評分標準Tab.1 Suzuki′s pathological scoring criteria for IRI

1.4 統計學方法計量資料數據用均數±標準差表示，均數間差異比較用單因素方差分析。計數資料的數據進行χ2檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。所有統計均采用SPSS 25.0軟件包進行分析。

2 結果

2.1 基本資料在未控制失血性休克SD大鼠模型的基本資料如MAP 及HR 由Pclab-530C 生物醫學信號采集系統采集，見圖1。空白組、對照組、實驗組1 與實驗組2 死亡率分別為0、50%、30%與20%，兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05）；0.5～1.5 h 補液量分別為0、（8.7 ± 2.9）、（7.5 ± 3.0）與（6.1 ± 1.9）mL，兩兩比較差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 各組的基本實驗資料Tab.2 Basic experimental data of each group±s

表2 各組的基本實驗資料Tab.2 Basic experimental data of each group±s

注：對照組分別與實驗組1 和實驗2 比較，*P ＜0.05；實驗組1 與實驗組2 比較，**P ＜0.05

h 失血量（mL）斷尾失血量（mL）0.5～1.5 h 補液量（mL） 時間（h）MAP（mmHg）HR（次/min）0130.5±15.3345±52 0.5130.5±15.3345±52 0 0 0 1.5130.5±15.3345±52組別空白組對照組實驗組1實驗組2死亡率（%）0 50*30**20 0～0.5 9.5±2.3 9.2±3.0 9.8±2.7 3.2±1.6 2.9±1.8 3.0±1.5 8.7±2.9*7.5±3.0**6.1±1.9 2.5 3.5 0 0.5 1.5 2.5 3.5 0 0.5 1.5 2.5 3.5 0 0.5 1.5 2.5 3.5 130.5±15.3 130.5±15.3 128.5±18.4 32.3±3.2 56.3±5.2 122.4±19.5 119.0±15.8 133.8±18.2 33.5±2.8 54.5±5.9 120.2±20.4 121.2±19.9 131.8±19.6 33.0±2.4 55.5±5.6 125.2±17.4 121.0±16.9 345±52 345±52 340±55 486±69 457±48 375±39 358±49 360±55 480±62 469±50 390±36 380±50 349±59 490±62 449±40 380±46 350±50

圖1 實驗組1、實驗組2 及對照組未控制失血性休克模型血壓和心率電腦采集圖（Pclab-530C 生物醫學信號采集系統）Fig.1 Computer images of blood pressure and heart rate of uncontrolled hemorrhagic shock models in experimental group 1，experimental group 2 and control group（PCLAB-530C biomedical signal acquisition system）

2.2 各組的TNF-α、IL-6 及肝功的變化實驗組2 TNF-α、IL-6 含量明顯低于實驗組1 與對照組（P＜0.05），實驗組1與對照組比較（P＞0.05）；而實驗組1 肝功能（ALT、AST）與實驗組2 比較差異無統計學意義（P＞0.05），實驗組1 與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表3。

表3 各組TNF-α、IL-6、ALT、AST 值Tab.3 TNF-α，IL-6，ALT and AST values in each group x±s

2.3 各組肝臟組織LTs、LTB4和5-LOX的變化實驗組1 與實驗組2 肝臟組織LTs、LTB4、5-LOX 值明顯低于對照組（P＜0.05）；且實驗組1 與實驗組2比較差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖2。

圖2 各組肝LTs、LTB4 和5-LOX 的變化Fig.2 Changes of liver LTS,LTB4 and 5-LOX in each group

2.4 各組肝組織MDA 及MPO 的變化空白組肝組織MDA 及MPO 值均低于對照組、實驗組1 及實驗組2（P＜0.05）；對照組肝組織MDA 及MPO 值均高于實驗組1 及實驗組2（P＜0.05）。見表4。

表4 各組肝組織MDA 及MPO 值Tab.4 MDA and MPO values in liver tissue of each group x±s

2.5 各組肝組織病理切片對照組較實驗組2 和實驗組1 肝細胞渾濁腫脹明顯，肝細胞大片狀變性壞死，大部分肝小葉組織結構破壞，炎性細胞浸潤明顯。見圖3。

圖3 各組肝組織病理切片（HE，×200）Fig.3 The pathological sections of liver tissue in each group were stained by（HE，×200）

2.6 各組肝組織的Suzuki′s 病理學評分對照組肝組織的Suzuki′s 評分值（5.60±1.58）高于實驗組1（3.35 ± 0.89）和實驗組2（3.29 ± 0.92），差異有統計學意義（P＜0.05）；實驗組1 與實驗組2 肝組織的Suzuki′s 評分值比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

3 討論

創傷失血性休克的處理主要在于早期的液體復蘇，恢復機體有效血容量，滿足組織的灌注，阻止器官組織缺血壞死［4-7］。然而，在液體復蘇時，往往引起組織再灌注損傷。組織產生大量的氧自由基，氧自由基可作為信息分子，廣泛激活炎癥系統，導致全身炎癥反應綜合癥（systemic inflammatoryresponse syndrome，SIRS），引起循環衰竭和器官損傷，進一步發展可導致多器官功能障礙綜合癥（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）甚至多器官功能衰竭（multiple organ failure，MOF）發生［8-11］。因此早期復蘇的效果及炎癥反應的控制直接決定了創傷后多器官功能不全綜合征、多器官功能衰竭的發生率。如何防治器官缺血再灌注損傷是救治失血性休克、治療并預防MODS、提高患者生存率的重要臨床問題。米諾環素是一種半合成的第二代四環素衍生物，它除了良好的抗菌作用外，還具有抗炎、抗凋亡、抑制基質金屬蛋白酶、清除氧自由基、免疫抑制等作用。研究表明［12-14］，米諾環素在多種臟器如腦、心、肺、肝等缺血再灌注損傷中發揮了組織細胞保護作用，減輕了組織缺血再灌注損傷。然而其機制有待進一步明確。

TNF-α、IL-6 能夠誘導多種促炎介質，如細胞因子和趨化因子，并最終導致廣泛的炎癥反應，進而損傷細胞及組織器官［15］。ALT 及AST 主要反映肝功能指標，當肝功能受損時ALT 及AST 則與損傷程度呈正相關。本研究結果顯示，在TNF-α、IL-6、ALT、AST 值的比較中，對照組與實驗組1 及實驗組2 分別比較，差異均有統計學意義，說明米諾環素與和5-LOX 抑制劑MK-886 均可抑制TNF-α 及IL-6，保護肝腎等多個器官。實驗組2 TNF-α、IL-6值低于實驗組1，但實驗組1 肝功能（ALT、AST）與實驗組2 比較差異無統計學意義，說明米諾環素與MK-886 在未控制失血性休克模型中對肝臟具有等同的保護作用，但米諾環素對除肝臟外的器官保護作用要優于MK-886。

5-LOX 不僅參與腫瘤及癌癥的發生發展，還與炎癥反應中的促炎因子的釋放密切相關［16］。MDA與MPO 不但與人類多種疾病的發生、發展密切相關，還參與調節炎癥反應的許多過程，在炎癥反應中大量的MDA 與MPO 聚集在炎癥部位而發生氧化反應，進而形成大量的超氧化物和氧化物，最終造成炎癥部位組織細胞損傷［17］。本研究結果顯示，對照組與實驗組1 及實驗組2 分別比較MDA及MPO 值有明顯差異，說明米諾環素與MK-886 均可抑制MDA 及MPO，保護肝腎等多個器官。但實驗組1 除肝臟組織MDA 及MPO 值與實驗組2 肝臟組織MDA 及MPO 值相近。但對照組與實驗組1肝組織5-LOX、LTs 和LTB4 值及實驗組2 分別比較差異有統計學意義，實驗組1 與實驗組2 比較，差異無統計學意義，說明米諾環素與MK-886 在未控制失血性休克模型中對肝臟均具有保護作用。肝組織的Suzuki′s 評分值也印證了上訴說法，說明米諾環素可能與MK-886 一樣，通過抑制5-LOX 發揮抗炎作用，從而發揮組織保護作用。

肝組織病理切片顯示對照組較實驗組2 和實驗組1 肝細胞渾濁腫脹明顯，肝細胞大片狀變性壞死，大部分肝小葉組織結構破壞，炎性細胞浸潤明顯。以上病理進一步說明了米諾環素與MK-886 在未控制失血性休克模型中對肝臟具有保護作用。本研究顯示米諾環素與MK-886 在未控制失血性休克模型中對肝臟保護的同時明顯降低了病死率。

綜上所述，在未控制失血性休克模型中MC 與5-LOX 抑制劑MK-886 一樣可通過抑制5-LOX 進而抑制LTs、LTB4、TNF-α、IL-6、MAD 和MPO 等炎癥介質和細胞因子，減輕缺血再灌注后器官組織和細胞的損傷，進而降低死亡率。為院前及院內急救使用米諾環素救治創傷性失血性休克所致的多器官衰竭的早期預防和治療提供新的思路和實驗依據。