miR-106a-5p靶向STAT3抑制膠質瘤細胞增殖和侵襲的機制

周輝 李睿春 顏大鈞 蔡東鵬 吳文佼 鐘德泉 姜曉丹

1南方醫科大學珠江醫院神經外科，國家臨床重點專科，腦血管病診斷與治療教育部工程研究中心，廣東省普通高校腦功能修復與再生重點實驗室，廣東神經外科研究所（廣州 510282）；2 廣東藥科大學附屬第一醫院神經外科（廣州 510080）

膠質瘤是神經系統最常見的惡性腫瘤之一，約占原發顱內腫瘤的50%左右，具有發病率、病死率高等特點［1］。治療以手術聯合放化療為主，但往往由于膠質瘤邊界不清，呈侵襲性生長，手術難以完全切除，術后易復發，預后極差。因此，關于膠質瘤復發機制的研究成為近年來關注的熱點［2］。微小核糖核酸（miRNA）參與細胞分化、增殖、代謝、信號轉導等生物過程［3-5］。據報道［6-7］，miR-106a-5p能抑制乳腺癌、肺癌等腫瘤細胞的增殖和侵襲，并且可作為膠質母細胞瘤患者的獨立預后預測指標［8］，但其對膠質瘤細胞增殖和侵襲能力的影響尚不清楚，本實驗擬研究miR-106a-5p 在膠質瘤細胞的增殖和侵襲中的作用機制，為防治膠質瘤的復發提供一種新的靶點。

1 材料與方法

1.1 標本材料

1.1.1 樣本來源收集廣東藥科大學附屬第一醫院神經外科2017年1月至2020年12月間接受再次手術治療的15 例復發膠質瘤患者的腫瘤標本，其中5 例取自癌旁組織（距腫瘤增強灶邊緣＞1.5 cm）。納入標準：患者第一次手術病理報告為膠質瘤（WHO 分級Ⅰ～Ⅳ級均可）；年齡＞18 歲，自愿接受再次手術；無明顯手術禁忌證。排除標準：心、肝、腎等器官功能障礙；凝血功能異常。本項目得到我院醫院倫理委員會審核（醫倫審［2017］第（76）號），參與研究的所有患者均已簽署知情同意書。

1.1.2 病例資料患者年齡37 ～64 歲，平均（50.12 ± 7.58）歲；男9 例，女6 例。臨床癥狀：頭痛、惡心嘔吐10 例，偏癱或失語4 例，癲癇1 例。病變位置：額葉7 例，顳葉3 例，頂葉3 例，枕葉2 例；腫瘤直徑＜5 cm 10 例、≥5 cm 5 例；第一次手術后病理類型：Ⅰ～Ⅱ級2 例，Ⅲ～Ⅳ級13 例；第一次術后患者KPS 評分60 ～90 分。復發時間4 ～26個月，平均（15.87±6.93）個月。5 例癌旁組織取自額葉腫瘤旁。

1.2 細胞培養小鼠神經元細胞及膠質瘤細胞株GL261（賽百慷，上海），正常培養體系：95%DMEM+ 5%胎牛血清（Gibco，美國）+ NGF 20 ng/mL（Affinity，美國）+谷氨酰胺100 μg/mL。

1.3 主要試劑與儀器熒光染料SYBR Green I（Invitrogen，美國），引物序列設計、慢病毒包裝及表達載體構建（銳博生物，廣州），Trizol 試劑盒（Sigma，美國），逆轉錄試劑盒（Vazyme Biotech，美國），LipofectamineTM2000 轉染試劑盒（Invitrogen，美國），一抗STAT3 蛋白（信號轉導與轉錄激活因子-3）、BAX 蛋白（Bcl-2 關聯X 蛋白）、cl-caspase-3蛋白（含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3）以及p21 蛋白（Affinity，美國）。Transwell 細胞培養皿（Gibco，美國），紫外可見分光光譜儀（Thermo，美國），定量PCR 儀（StepOnePlus?，美國）。

1.4 方法

1.4.1 qPCR 檢測細胞中miR-106a-5p 和STAT3水平提取細胞總RNA（Trizol 法）并測定純度和濃度，按逆轉錄試劑盒逆轉錄。SYBR Green 染料法進行定量PCR，反應條件：95 ℃下使模板DNA變性30 s →55 ℃下退火30 s →72 ℃延伸60 s，循環30 次。最后在72 ℃下擴展10 min，收集熒光信號。各樣品重復3 次。內參為GAPDH，使用2-ΔΔCT法計算miR-106a-5p 和STAT3 的相對表達量。引物序列見表1。

1.4.2 細胞轉染與分組將GL261 細胞按按105/mL 接種于6 孔板中，分別轉染構建的miRNA-NC mimics、miR-106a-5p mimics、miR-106a-5p inhibitor質粒（銳博生物，廣州）24 h，并對應分組，正常的GL261 為Control 組。具體轉染步驟參照LipofectamineTM2000 試劑盒進行。

1.4.3 蛋白質印跡（WB）檢測各組細胞凋亡相關分子表達將各組細胞置于冰上，裂解1 h 后提取總蛋白（RIPA 法），檢測蛋白濃度（BCA 法），每孔上樣50 μg。配置10%分離膠（SDS-PAGE 凝膠配制試劑盒），140 V 電壓電泳1.5 h。按分子量切取相應目的條帶，電轉至PVDF 膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。滴加相應兔抗小鼠STAT3、BAX、cl-caspase-3、p21 一抗（1∶1 000），并在4 ℃孵育過夜。用1×TBST 洗膜3 次，次日滴加山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h。洗膜3 次。增強化學發光法（ECL）顯影。選擇GADPH 作為內參，用Image J 軟件測定目的蛋白灰度值，按目的蛋白灰度值除以GADPH 灰度值計算其相對表達量。

1.4.4 TargetScan 預測和雙熒光素酶報告確定miR-106a-5p和STAT3的關系借助在線生物信息分析軟件TargetScan7.1（http：//www.targetscan.org/），預測出STAT3 是miR-106a-5p 的靶基因之一。再利用雙熒光素酶基因報告實驗驗證二者間的靶向關系；依據預測的可能結合位點，分別構建包含該位點（Wt）和突變位點（Mut）的DNA 片段（銳博生物，廣州）；并將其與miR-106a-5p 共轉染至GL261 中培養48 h，最后測定熒光素酶的活性。

1.4.5 CCK-8 實驗測定過表達miR-106a-5p 在GL261 增殖中的作用在96 孔板中按適當密度接種轉染miR-106a-5p mimics 的GL261，培養基每2天更換一次。并在12、24、48、72 h查看細胞狀態，然后各孔添加CCK-8 溶液10 μL 后孵育4 h，使用酶標儀測定450 nm 處各孔細胞的吸光值（A450），繪制增殖率曲線，細胞增殖率=（A實驗-A空白）/A空白×100%。

1.4.6 Transwell 實驗測定miR-106a-5p mimics 對GL261 侵襲力的作用先在Transwell 培養皿內室中鋪上新鮮制備的Matrigel 基質膠，37 ℃干燥2 h。再將轉染miR-106a-5p mimics 的GL261 細胞接種于Transwell 的內室，在下室中加入DMEM 培養基（含20%胎牛血清）500 μL，置于37 ℃、5%CO2恒溫細胞培養箱中，培養2 d 后輕輕擦去內室底部Matrigel 膠和未侵襲的GL261 細胞，多聚甲醛固定30 min，DAPI 室溫下染色30 min，在顯微鏡高倍視野下對細胞進行拍照和計數。

1.5 統計學方法對實驗數據采用SPSS 20.0（IBM，美國）進行統計處理，計量數據若符合正態分布，以均數±標準差表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 方法；若是偏態分布時，采用非參數秩和檢驗。計數變量采用例數和百分數表示，比較采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-106a-5p 在人復發膠質瘤組織和GL261細胞中的水平qPCR 結果顯示，在人復發膠質瘤組織中，miR-106a-5p 水平明顯少于周圍癌旁組織（P＜0.01）。在GL261 膠質瘤細胞中的水平也顯著低于正常神經細胞（P＜0.05），見圖1。

圖1 人復發膠質瘤組織和GL261 中miR-106a-5p 的水平Fig.1 The levels of miR-106a-5p in human recurrent glioma and GL261

2.2 轉染miR-106a-5p 模擬物的GL261 中STAT3的表達水平相比Control 組，轉染了miR-106a-5p mimics 質粒的GL261，miR-106a-5p 的水平明顯升高（P＜0.01），同時STAT3 的表達水平顯著下調（P＜0.01）；在miR-106a-5p inhibitor組中，miR-106a-5p 水平明顯降低（P＜0.01），STAT3 的表達顯著上調（P＜0.01）。

圖2 miR-106a-5p 的表達對GL261 中miR-106a-5p 和STAT3 的影響Fig.2 Expression of miR-106a-5p affects the levels of miR-106a-5p and STAT3 in GL261

2.3 雙熒光素酶驗證miR-106a-5p 和STAT3 的靶向關系TargetScan 在線數據庫預測miR-106a-5p與STAT3 的3′UTR 存在部分結合位點（圖3A），預測miR-106a 對STAT3 的表達具有一定調控作用。在雙熒光素酶基因報告中，顯示共轉染STAT3-WT野生型和miR-106a-5p mimics 的細胞中熒光素酶活性明顯降低（P＜0.01，圖3B），驗證了miR-106a-5p 與STAT3 之間存在著互為靶向的關系。

圖3 預測和驗證miR-106a-5p 與STAT3 間的相互關系Fig.3 Predict and verify the relationship between miR-106a-5p and STAT3

2.4 過表達miR-106a-5p 對GL261 細胞增殖和侵襲的影響CCK-8 和Transwell 結果顯示，相比Control 組，miR-106a-5p mimics 組GL261 細胞增殖數量明顯減少（P＜0.05，圖4A），細胞侵襲能力也顯著下降（P＜0.01，圖4B）。

圖4 過表達的miR-106a-5p、在GL261 增殖與侵襲中的作用（×400）Fig.4 Over-expression of miR-106a-5p affects on proliferation and invasion in GL261（×400）

2.5 蛋白質印跡檢測各組GL261 中相關凋亡分子的表達蛋白質印跡結果顯示，與Control 組相比，miR-106a-5p mimics 組STAT3 的表達顯著下降（P＜0.01），但BAX、cl-caspase-3 及p21 的表達顯著上升（P＜0.01）；miR-106a-5p inhibitor 組STAT3 表達顯著升高（P＜0.01），BAX、cl-caspase-3 及p21 的表達顯著下降（P＜0.05），見圖5。

圖5 miR-106a-5p 對GL261 中BAX、cl-caspase-3 和p21 水平的作用Fig.5 The levels of Bax,cl-caspase-3 and p21 in GL261 were affected by mir-106a

3 討論

膠質瘤是中樞神經系統最常見的一類惡性腫瘤，約占顱內原發腫瘤的50%左右，預后極差，其中高級別膠質瘤患者的平均生存期僅有12 ～15 個月［1］。如何延長膠質瘤的復發時間，提高患者生存時間，成為膠質瘤研究的核心。目前，手術的切除程度、術后放化療或其他新興分子靶向藥物等是研究控制膠質瘤復發的主要方向［9］。以往很多研究發現miRNA 可以通過介導調控靶基因的表達參與多中癌癥的發生發展及復發，本團隊以往也證實miR-107 參與膠質瘤干細胞的生長和侵襲［10］，但鮮有報道miRNA 的異常表達在膠質瘤復發中發揮作用的機制。有學者證實，miR-106a-5p是多種腫瘤潛在的抑癌基因，并且可以作為一個獨立的標記物對膠質瘤患者治療效果和預后進行評價［6-9］。然而其在膠質瘤，尤其在復發膠質瘤中的生物特性及作用機制尚未明確。本研究中首次收集15 例復發膠質瘤患者再次手術切除的腫瘤組織與5 例癌旁組織樣本，通過qPCR 檢測miR-106a-5p 的水平，發現miR-106a-5p 在復發膠質瘤組織中的表達水平明顯低于癌旁組織，與文獻報道［10］的在原發膠質瘤中低表達一致，表明miR-106a-5p 也可以作為抑制復發膠質瘤生長的一個潛在靶點。

STAT3 是細胞內廣泛存在的信號轉錄因子家族之一，被認為是促癌基因，參與多種腫瘤細胞的增殖、分化、侵襲與凋亡［11］。有學者發現STAT3在腎癌細胞中高表達，通過抑制STAT3 的激活來抑制腎癌細胞增殖與侵襲［12］。在膠質瘤細胞中STAT3 也明顯增強，抑制JAK2/STAT3 信號通路也能夠顯著抑制膠質瘤細胞的增殖，促進細胞凋亡［13］。因此在本研究將miR-106a-5p 模擬物轉染至小鼠膠質瘤細胞株GL261 中，觀察二者之間的表達量的關系，發現miR-106a-5p 負調控STAT3 的表達。接著通過TargetScan 生物在線軟件預測了STAT3 就是miR-106a-5p 的靶基因，進一步雙熒光素酶基因報告證實了它們二者之間的相互作用。結果顯示，過表達miR-106a-5p 可下調STAT3 的水平，同時過表達miR-106a-5p 可以下調GL261 細胞的增殖和侵襲能力，表明STAT3 是miR-106a-5p 的下游靶基因。

以往研究顯示，STAT3 激活可以干擾腫瘤細胞的凋亡，通過上調p21、cl-caspase-3 的表達促進腎癌細胞的凋亡，同時STAT3 也參與BAX、cl-caspase-3、p21 等蛋白的表達［14-15］。在LIAO 等［16］的實驗中，阻斷STAT3 在腫瘤組織中的激活，增加了BAX、p21 的水平，下調Bcl-2 的表達，進而誘導癌細胞凋亡，降低了腫瘤體積和腫瘤質量。其中BAX、cl-caspase-3 是凋亡相關因子［17-18］，p21 是周期蛋白依賴激酶抑制基因［19］，在細胞的凋亡過程中也發揮著重要作用。本研究結果也顯示，miR-106a-5p 的過表達在下調STAT3 表達的過程中，也升高了BAX、cl-caspase-3 和p21 的表達水平，有可能通過調控腫瘤細胞的凋亡來抑制膠質瘤的生長，有待以后進一步的研究。

綜上，miR-106a-5p 低表達于人復發膠質組織和膠質瘤細胞中，過表達miR-106a-5p 可抑制膠質瘤細胞中STAT3 的表達，減弱膠質瘤細胞的增殖與侵襲能力，同時促進細胞凋亡相關因子BAX、clcas-pase-3 及抑癌基因p21 的表達，為防治膠質瘤的復發提供了一個新的靶點。