宏基因組學二代測序技術在感染性呼吸系統疾病病原體診斷中的應用進展

王慧林，劉雪

鄭州市第三人民醫院呼吸與危重癥醫學科， 河南 鄭州 450000

感染性呼吸系統疾病發病率居各類感染性疾病之首，提高治愈率、降低死亡率的關鍵仍在于早期明確感染的病原體。目前，病原體培養仍是臨床病原學診斷的主要方式，但其有無法檢測某些(如苛養菌、部分病毒、胞內菌等)不能常規培養的病原體的局限性。定量聚合酶鏈反應(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)則僅能定向檢測病毒及部分細菌，對未知病原體不能檢測是其缺陷。隨著臨床檢測技術的發展，基于二代基因測序技術的宏基因組學技術在臨床應用越來越廣泛，并取得一定的進展。現將其在感染性呼吸系統疾病中應用的優勢與局限進行綜述，期望為臨床工作者提供參考。

1 概況

下一代基因測序技術(next-generation sequencing, NGS)又稱二代基因測序技術、大量并行測序技術 (massive parallel sequencing, MPS)、高通量測序技術(high-throughput sequencing, HTS)，2008年成功應用于臨床診斷新發病原體感染[1-2]，其可直接對臨床樣本中的核酸進行高通量測序，然后與數據庫進行對比分析，從而判斷出樣本中的病原微生物種類。該技術具有成本低、準確度高(>99%)、效率高(1次可對幾百、幾千個樣本的幾十萬至幾百萬條 DNA 分子同時進行快速測序分析)等優勢，并且無需特異性擴增[3-7]。它既可在一次測試中同時運行多個不同患者的病原體的全基因組測序，又可以對來自同一個體不同臨床樣本的多個菌種的基因測序。目前臨床應用的基于NGS平臺的基因測序方法包括：16S rRNA 、宏基因組學二代測序技術(metagenomics next-generation sequencing, mNGS)、元轉錄組學和代謝組學。由于病毒或真菌不攜帶16S rRNA基因，因此，16S rRNA測序分析僅限于細菌的檢測。mNGS可以對樣品中遺傳成分無限制DNA測序，它不僅可以捕獲細菌，還可以捕獲基于DNA的病毒和真核DNA，包括真菌微生物。與16S rRNA基因方法相比，mNGS對微生物基因組的不同區域進行測序，將短測序讀段組裝成更大的片段，可以增加微生物之間的區分能力，從而提高分類學分辨率，甚至物種或菌株水平。臨床應用較多的是16S rRNA、mNGS，已納入檢測范圍的病原體有8000多種，包括3000多種細菌、4000多種病毒、200多種真菌和140種寄生蟲，為感染性疾病尤其是少見病原微生物感染的診斷提供了有效的技術手段。

2 mNGS在呼吸系統感染中的檢測價值

2.1 mNGS在呼吸系統感染中不同來源標本的檢測應用

在呼吸系統感染中，可用于mNGS檢測的標本有靜脈血、咽部分泌物、痰液、胸水、肺組織、肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)等。其對痰、咽部分泌物、BALF等標本的檢測表現出良好的診斷性能[8-9]。就細菌及真菌而言，mNGS檢測血液標本的靈敏度及特異度分別為72.7%和89.6%，若血培養聯合mNGS，陽性率較單用血培養顯著升高[10]。分別用mNGS與組織病理學方法檢測肺活檢組織，mNGS對真菌和結核分枝桿菌復合體的特異性更高(100.0vs.94.1%)，陽性預測值更高(100.0vs.75.0%)[11]。Miao等[12]對472例感染樣本(其中149例(29.2%)來自BALF、143例(28.6%)來自痰液、55例(10.8%)來自胸水、44例(8.6%)實體組織、43例(8.4%)膿及38例(7.4%)血漿)的研究發現，在痰和組織樣本類型中，mNGS與常規培養檢測方法比較，其敏感性顯著升高。在不同樣本類型中，mNGS整體敏感性沒有差異。其中，非結核分枝桿菌患者的BALF陽性率高于痰液(P<0.01)，結核分枝桿菌、曲霉或隱球菌則無差異。

2.2 mNGS在特定的感染中具有較高的診斷價值

在呼吸系統感染的病原學檢測方面，與傳統微生物檢測方法(BALF微生物培養，涂片顯微鏡檢查和肺活檢組織病理學)相比，mNGS能夠快速、準確地檢測和鑒定病原體，對同時檢測數百種已知病原體具有很高的敏感性，但特異性并不優于傳統微生物檢測方法。Huang等[13]對171例大多為免疫低下的肺部感染患者的回顧性研究認為，mNGS能夠識別近89%的肺部感染患者，高于傳統的病原體檢測方法(25.73%)。但mNGS的特異性較低，為81.16%，而傳統方法的特異性為88.41%(P=0.639)。Pan等[14]對13例免疫功能低下社區獲得性肺炎(community acquired pneumonia, CAP)患者的對比研究發現，在細菌檢測方面mNGS沒有顯示出明顯的優勢。然而，mNGS在常規檢測方法難以確診、少見病原體、未知病原體以及在同時檢測細菌、真菌和病毒方面顯示出了優勢。Zhang等[15]對21例心肌炎患者的14個臨床樣本同時使用mNGS和病原體培養進行檢測，發現14個樣本的mNGS檢測結果均為諾卡菌陽性，而只有5個樣本獲得了培養陽性結果，9個樣本培養失敗，住院期間重復培養也未得到陽性結果。該結果表明，與常規方法相比，mNGS在檢測諾卡菌時更有效、更靈敏。另外，Chen等[16]也報告了利用mNGS診斷出9例嚴重的鸚鵡熱肺炎。Wang等[17]對55例混合肺部感染患者(其中33例以血液病為基礎疾病)進行mNGS檢測與常規檢測，結果發現，通過mNGS鑒定了5種病原體(膿腫分枝桿菌、根瘤菌、副流感嗜血桿菌、肺炎根瘤菌和肺炎鏈球菌)，但常規檢測未檢出；mNGS的敏感性(97.2%)比常規檢測(13.9%)顯著增高，而特異性(63.2%)比常規檢測(94.7%)低。Zhang等[18]研究發現，在13例肺結核病例中，mNGS的敏感性與Xpert相同(62%)，優于傳統檢測方法(38%)，在胸腔積液中則比Xpert稍差。在16例結核性腦膜炎患者的CSF樣本中，mNGS的敏感性為44%，遠高于Xpert(19%)和常規方法(19%)。其可能的原因如下。①樣品收集和處理的影響。②結核分枝桿菌細胞內生長特性，釋放出較少的細胞外核酸。③mNGS高度依賴于覆蓋范圍，盡管可以識別結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌，但由于內部同源性很高，在覆蓋率不足的情況下，很難確定結核分枝桿菌復合體中的種類。④抗結核治療顯著降低了診斷敏感性。另外，在非典型病原體方面，mNGS亦顯示出了較好的診斷性能[19]。以上研究表明，mNGS在混合感染、免疫抑制患者感染、少見病原體及結核分枝桿菌感染的診斷中具有較高的應用價值。

2.3 mNGS在真菌感染方面的診斷優勢

對于真菌感染的檢測，傳統檢查方法常難以滿足臨床需求。Wang等[17]通過mNGS在55例病例中鑒定出真菌31例(56.4%)，而常規方法檢測只有10例(18.2%)真菌陽性。由mNGS鑒定出3例根霉菌，而所有常規檢測方法均未檢測到。對曲霉菌的鑒定中，mNGS檢出的陽性病例數(14例，25.5%)多于常規方法檢測確定的陽性病例數(9例，16.4%)。Miao等[12]系統地比較了同標本的mNGS的檢測結果和常規培養結果，發現mNGS在檢測真菌方面具有更好的可行性[OR，4.0 (95%CI，1.6～10.3)；P<0.01]。Li等[11]對20例肺部感染患者穿刺肺活檢組織使用mNGS檢測發現，與涂片法比較，mNGS對真菌檢測的靈敏度和特異性分別為62.5%(95%CI: 25.9-89.8%)和66.7%(95%CI: 35.4-88.7%)。與培養法比較，mNGS對真菌檢測的靈敏度和特異性分別為57.1% (95% CI: 20.2-88.2%)和61.5% (95% CI: 32.2-84.9%)。與組織病理學方法相比，mNGS對真菌檢測的特異性和陽性預測值最高達100.0%。此研究雖有樣本量小、mNGS的深度以及肺活檢組織中存在大量的人類DNA片段等局限，但仍能表明mNGS可以改善肺活檢組織中肺部感染性病原體的檢測，且在檢測速度、敏感性、特異性方面具有潛在的優勢。

2.4 mNGS在病毒檢測方面的應用價值

常規病毒檢測方法如病毒培養、核酸檢測等是建立在已知病原體基礎上進行的，對未知病毒病原體的檢測存在缺陷。而mNGS可快速獲得完整的基因組序列，而且靶標不受病原體已有知識的限制，還能準確鑒定新發、突發的病毒性病原體[20]，比傳統的病毒檢測方法有顯著的優勢。Lewandowska等[21]認為無偏倚的mNGS可補充特定的常規診斷方法，并增加稀有病毒檢出的機會。Thorburn等[8]研究發現，mNGS檢測鼻咽拭子中病毒的靈敏度為77.55%，特異性為80.49%。而Anneloes等[22]使用mNGS對63例慢阻肺急性加重期患者的88個鼻咽拭子樣本進行了呼吸道病毒分析，24個樣本檢測為陽性，與PCR相比，診斷目標的敏感性和特異性分別為96%和98%。為了增加通過mNGS獲得病毒序列的比例，研究者采用了多種特異性病毒富集方案，如宿主核酸耗竭、平鋪多重PCR和捕獲探針富集等。Yang等[23]通過Illumina TruSeq RNA Access Library程序，使用大量寡核苷酸探針富集34種呼吸道DNA和RNA病毒進行靶向測序。O’Flaherty等[24]使用了針對常見呼吸道病毒的兩個寡核苷酸探針組來減少NGS數據中的非病毒讀取，實現病原體鑒定的高性能和與分子分析相當的病毒檢測靈敏度。Deng等[25]開發的MSSPE富集方法簡單、成本低、快速、與不同的文庫制備方案兼容。與其他NGS富集策略相比，MSSPE的擴增偏差較小(～20%重復讀數，而其他方法為80%～95%)，樣品交叉污染更少。尤其是在以10到107cp ml-1的病毒滴度測試模擬和臨床樣品時，用MSSPE觀察到極少或沒有交叉污染?？墒窃摲椒]有對冠狀病毒、流感病毒進行測試；也沒有針對雙鏈RNA病毒、DNA病毒或非病毒病原體進行正式測試，但與其他方案結合使用，可進一步提高檢測效能。需要強調的是mNGS測序可以檢測細菌、基于DNA的病毒和真核DNA，但由于大多數呼吸道病毒是RNA病毒，因此檢測RNA病毒需先轉化為互補DNA(cDNA)再進行測序[26]，但在體外逆轉錄后的測序過程中較易產生系統誤差。此外，與來自細菌和宿主的遺傳物質相比，RNA病毒遺傳物質的豐度相對較低且容易降解，因此對RNA病毒的檢測率較低。

3 mNGS在細胞因子檢測中的應用

mNGS還可用于細胞因子的檢測，莊華東等[27]應用mNGS檢測支原體肺炎患兒肺泡灌洗液中Th1細胞因子γ干擾素(interferon-gamma, IFN-γ)、Th2細胞因子白細胞介素-4(IL-4)的表達水平及免疫應答平衡的變化趨勢，結果表明支原體肺炎患者中IL-4/IFN-γ比值較支氣管異物患者升高，說明感染后免疫調節功能出現紊亂。

4 mNGS在耐藥基因檢測中的應用

mNGS 數據已經用于篩選抗菌藥物耐藥基因, Aanensen等[28]、Giulieri等[29]對金黃色葡萄球菌分離株的全基因組學數據進行了流行病學和耐藥數據的研究，發展出了在臨床感染結局分層和持續性/復發性感染管理方面的潛在臨床應用。研究顯示mNGS已用于cyp51A基因的高分辨率分析，以鑒定煙曲霉與唑類抗真菌藥耐藥相關的單核苷酸多態性(single nucleotide polymorphism, SNP)，并進行進化分析。此外，mNGS還被用于研究念珠菌屬物種中的唑類和棘皮菌素類抗性菌株。其中SNP分析證實TR 34/L98H突變是引起唑類抗真菌藥耐藥的最常見原因[30]。Hadjadj等[31]運用全基因組學測序技術對部分常見的容易發生多重耐藥的病原體進行了耐藥基因檢測，如mcr-1、mcr-3、mcr-8可能是耐藥腸桿菌科中肺炎克雷伯桿菌的耐藥基因傳播標志之一。Angela等[32]發現全基因組學可以更全面地識別成功克隆中的新型毒力或抗性因子，并描述了物種基因組具有的高可塑性。但由于抗生素耐藥性數據庫的更新周期較長和缺乏標準化、耐藥機制復雜、耐藥基因與實際耐藥表型并不完全一致、微生物表達未知的抗菌藥物耐藥性基因等因素[33]，目前還不能使用mNGS進行常規抗生素敏感性測試。

5 mNGS臨床應用的局限性

盡管mNGS具有較大的應用潛力，但由于諸多原因，其臨床應用一直落后于研究進展。可能的原因如下。首先，被檢測到的微生物是否是污染物，是定植菌還是致病菌，以及是否有人類背景菌的干擾等問題常不確定。雖然研究者使用了諸如mNGS結合16S rRNA靶向測序、多種宿主核酸耗竭法、對實驗室試劑定期評估、檢測設備擦拭測試、設置陰性對照以及嚴格遵守試劑使用規范和工作流程質控進行校正等諸多方法，但仍無明顯改觀。其次，mNGS結果判斷尚缺乏公認標準。通常認為微生物的檢出序列數、檢測深度、檢測離散度和基因組覆蓋度越高，檢測出的微生物的可靠性就越高。然而，對于細菌感染的檢測診斷，需排除背景菌、污染菌和定植菌后，方可考慮該微生物是致病病原體；不同的測序平臺采用不同的數據庫、不同的核酸提取率、不同的檢測限度，但臨床實際應用時仍難判斷；對毒力高、致病性強但檢出序列數很低的病原體仍需結合病情及其他臨床資料謹慎解讀。第三，胞內菌和厚壁微生物的DNA難以釋放入血，通常測得的序列數較低，覆蓋度亦較低，影響了檢測的靈敏性和特異性。第四，如前所述，mNGS檢出的結果有時還需借助傳統檢測方法進行驗證。最后，出于成本、周轉時間、監管、臨床效用等方面的考慮，目前mNGS難以常規應用于臨床。

6 展望

mNGS作為一種新興的檢測技術，正越來越多地服務于臨床，其覆蓋病原體廣泛、檢測快速、無偏倚、無需特異性擴增的優勢，在罕見感染、混合感染、免疫抑制患者感染和常規檢測方法難以檢測到病原體的診斷中有較高的臨床應用價值；但也存在特異性較低、公認判讀標準缺乏、測序結果與治療關系不明確、耐藥基因檢測困難、價格較高等不足。呼吸系統感染又有著不同于其他部位感染的特性，這無疑增加了提高mNGS臨床效用的難度。目前，在臨床應用中，mNGS與傳統微生物檢測技術具有相互補充的作用，兩者結合使用能夠提高臨床診斷效能。隨著mNGS技術的進一步發展、臨床應用的增加及相關研究的完善，相信它將會被更廣泛地應用于臨床。

mNGS作為一種新興的檢測技術，正越來越多地服務于臨床，其覆蓋病原體廣泛、檢測快速、無偏倚、無需特異性擴增的優勢，在罕見感染、混合感染、免疫抑制患者感染和常規檢測方法難以檢測到病原體的診斷中有較高的臨床應用價值；但也存在特異性較低、公認判讀標準缺乏、測序結果與治療關系不明確、耐藥基因檢測困難、價格較高等不足。呼吸系統感染又有著不同于其他部位感染的特性，這無疑增加了提高mNGS臨床效用的難度。目前，在臨床應用中，mNGS與傳統微生物檢測技術具有相互補充的作用，兩者結合使用能夠提高臨床診斷效能。隨著mNGS技術的進一步發展、臨床應用的增加及相關研究的完善，相信它將會被更廣泛地應用于臨床。

致謝

感謝上海瑞金醫院呼吸與危重癥醫學科周敏教授在論文修改中給予的指導。