病毒性肺炎患者外周血干擾素刺激基因15 mRNA表達特征的研究

韋棟，陳詠妍，時國朝，張欣欣，王穎

1. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院感染科臨床病毒研究室, 上海 200025； 2. 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院呼吸科, 上海 200025； 3. 上海交通大學醫學院上海免疫學研究所, 上海 200025

呼吸道病毒長期以來一直是呼吸道感染的主要致病原之一，其傳播給全球公共衛生防治工作造成了巨大的負擔。近年來隨著病原體診斷技術的提高，越來越多的證據表明呼吸道病毒已經成為社區獲得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)的最主要致病原之一[1]。由于呼吸道病毒感染所涉及的病毒種類繁多，其致病機制各不相同，所以目前臨床上缺乏使用呼吸道病毒感染的宿主標志物作為輔助診斷的手段。近年來，大量研究證明部分干擾素刺激應答基因的表達水平可能與病毒性感染高度相關[2-3]。干擾素刺激基因(stimulated gene, ISG)15是干擾素刺激應答基因的一員。目前有許多證據表明ISG15與病毒感染，特別是以流感為首的呼吸道病毒感染引起的免疫防御的機制密切相關[4-6]。ISG15可在I型干擾素(interferon-I，IFN-I)刺激下被強烈誘導表達[7]，大量研究已經證實ISG15可以介導多種抗病毒反應，在固有免疫及干擾素調節通路中發揮重要作用[8]。ISG15可以通過結合病毒蛋白來干擾病毒蛋白功能，進一步影響病毒的復制能力[9]；同時，ISG15也可以通過抑制病毒顆粒的釋放來干擾病毒感染[10]；除了直接影響病毒復制外，ISG15還可以通過發揮免疫調節作用調節病毒感染期間宿主的損傷和修復反應，間接影響病毒復制及造成的損傷，從而發揮抗病毒作用[11-14]。由于ISG15已經被證明具有廣譜抗病毒作用，可以影響包括人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、流感病毒、呼吸道合胞病毒、柯薩奇病毒、埃博拉病毒和肝炎病毒等多種病毒的復制，因此它在宿主感染過程中的表達變化可能具有重要的臨床價值[15]。

本研究同時收集了病毒性CAP和細菌性CAP住院患者臨床數據及外周血樣本，通過實時反轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription polymerase chain reaction，real-time RT-PCR)對不同病原CAP患者的外周血ISG15 mRNA表達水平進行分析，并在體外通過病毒刺激外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)進行驗證。探究ISG15同CAP發病機制及疾病活動性之間的可能聯系，為臨床進一步尋找呼吸道病毒感染的特異性宿主標志物提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

收集2018年11月至2019年6月上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院收治的社區獲得性肺炎住院患者157例，其中呼吸道病毒感染133例，細菌性感染24例，無細菌、病毒共感染患者，同時在健康體檢人群中選取40例作為健康人對照。全部患者診斷均符合中華人民共和國國家衛生健康委員會發布的《中國成人社區獲得性肺炎診斷和治療指南》診斷標準，所有入組患者入院時主訴均為近3～5 d內出現發熱癥狀，且無其他醫院就診經歷，入院后均采集鼻、咽拭子進行呼吸道病毒核酸檢測及痰液細菌培養以明確病原學診斷。研究入組人員標準包括：發熱、咳嗽、咳痰、伴或不伴胸痛；白細胞計數>10×109/L或<4×109/L，伴或不伴核左移；胸部X線檢查或計算機斷層掃描(computed tomography，CT)檢查顯示片狀、斑片狀浸潤陰影或間質性改變，伴或不伴胸腔積液。所有入組患者均無腫瘤病史。相關研究通過上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院倫理委員會審核(倫理審批：2018-48)。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物根據美國國立生物技術信息中心 (National Center for Biotechnology Information，NCBI)數據庫中甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)及ISG15 mRNA全長序列為模板設計引物。ISG15 mRNA 上游引物序列5′-ACCTGACGGT-GAAGATGCTG-3′，下游引物序列5′-TCCTCAC-CAGGATGCTCAGA-3′，產物長度252 bp。內參GAPDHmRNA上游引物序列5′-CGGAGTC-AACGGATTTGGTCGTAT-3′，下游引物序列5′-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3′，產物長度307 bp。全部引物均由鉑尚生物技術(上海)有限公司合成。

1.2.2 外周血收集及總RNA提取取患者及健康人乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)抗凝血1.5 mL，分裝后-80 ℃保存，采用TRIzol試劑(天根生化科技有限公司)進行后續的總RNA提取。將200 μL外周血樣本與600 μL TRIzol試劑充分混合，室溫靜置5 min。加入120 μL氯仿，振蕩混勻后室溫放置3 min，4 ℃ 13 400×g離心15 min，取上層水相層轉移至新離心管中，加入等體積異丙醇后混勻，室溫靜置 10 min。4 ℃ 13 400×g離心10 min，棄去上清液后加入 600 μL 75%乙醇洗滌。4 ℃ 12 000×g離心5 min，完全棄去液體。置室溫空氣中干燥后加入60 μL去RNA酶水，充分溶解RNA。使用Nanodrop 2000超微量分光光度計(Thermo Fisher公司，美國)進行RNA定量，同時檢測其A260/A280比值，當RNA濃度≥10 ng/μL，A260/A280比值≥2時方可進行后續real-time RT-PCR并分析。

1.2.3 實時反轉錄聚合酶鏈反應采用HiScript II One Step qRT-PCR SYBR Green逆轉錄試劑盒(南京諾維贊生物科技有限公司)檢測提取合格的RNA中的目的基因表達，反應體系如下：2×One Step SYBR Green Mix 10 μL，One Step SYBR Green Enzyme Mix 1 μL, 上下游引物各1 μL，RNA模板2 μL，加去RNA酶水補齊至總體積 20 μL。采用Light Cycler熒光定量核酸擴增儀(Roche公司，瑞士)進行反應，反應條件為：50 ℃ 15 min(逆轉錄)，95 ℃預變性 5 min，(95 ℃ 15 s，60 ℃退火30 s)×40個循環。ISG15 mRNA的表達水平按照ΔRn值[2-(CT目的基因-CT內參基因)]進行計算獲得。

1.2.4 PBMC分離及體外感染實驗所使用PBMC來自3位健康志愿者。采用Ficoll淋巴細胞分離液分離抗凝全血，獲得的PBMCs經磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)洗滌2次后，使用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養48 h。待細胞濃度達到6×105/mL，分別使用感染復數(multiplicity of infection, MOI)為0.2、0.02及0.002的甲型流感病毒H1N1病毒株及人鼻病毒(human rhinovirus，HRV)病毒株(HRV-A)進行感染，于37 ℃、5% CO2條件下分別培養12、24、48、72 h后進行real-time RT-PCR檢測病毒載量和PBMCs中ISG15 mRNA表達水平，每組條件設3孔平行試驗。病毒載量檢測使用羅氏TIB公司呼吸道病毒系列檢測試劑盒(Roche公司，瑞士)，并嚴格按照說明書進行操作。

1.2.5 統計學分析使用SPSS11.0進行統計學分析。多組樣本間比較使用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，對ISG15 mRNA的ΔRn值與白細胞計數、C反應蛋白(C reactive protein，CRP)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)結果進行Pearson相關性檢驗，P<0.05為具有統計學差異。受試者操作特征 (receiver operator characteristic，ROC) 曲線根據陽性率(sensitivity)和假陽性比例 (1-specificity)進行繪制，曲線下面積(area under ROC curve，AUC)值根據95% 可信區間計算獲得。

2 結果

2.1 患者基本特征

共收集了157例CAP住院患者(CAP組)外周血樣本及40例健康人(健康對照組)外周血樣本。157例患者中呼吸道病毒感染患者133例，細菌性感染患者24例。呼吸道病毒感染中甲型流感病毒(influenza A virus，IAV)32例， HRV 23例，呼吸道合胞病毒(respiratory syncy-tial virus, RSV)28例，人偏肺病毒(human metapneumovirus, hMPV)15例，副流感病毒3型(parainfluenza virus 3, PIV3)14例，冠狀病毒(coronavirus, CoV)21例。24例細菌性感染患者痰液樣本經細菌培養后均為陽性，其中肺炎克雷伯菌13例、流感嗜血桿菌6例、肺炎鏈球菌4例、鮑曼不動桿菌1例，全部細菌性感染患者均排除院內感染可能。男性118例(CAP組94例，健康對照組24例)，女性79例(CAP組63例，健康對照組16例)，年齡分布為62.2±21.6歲。CAP組內各類病原體感染者性別和年齡構成均無顯著性差異。進一步比較呼吸道病毒感染與細菌性感染患者的各項臨床特征，包括年齡、性別、白細胞計數、C反應蛋白及降鈣素原水平差異，結果提示呼吸道病毒感染與細菌性感染患者在年齡、性別方面均無顯著性差異，白細胞計數與降鈣素原水平差異較大，但C反應蛋白差異并不明顯。具體情況見表1。

表1 呼吸道病毒感染患者與細菌性感染患者臨床特征比較

2.2 不同致病原CAP患者的外周血ISG15 mRNA表達水平分析

采用real-time RT-PCR測定CAP組不同致病原患者外周血中ISG15 mRNA的表達水平，與健康對照組相比，ISG15 mRNA在呼吸道病毒感染組中平均表達水平顯著增高，不論是同健康對照組相比或是同細菌感染組相比均有顯著差異(見圖1A)；而細菌感染組外周血中ISG15 mRNA的水平顯著低于病毒感染組，與健康對照組相比差異并不明顯(圖1B)，提示不同病原體感染可以導致外周血ISG15 mRNA的差異性改變。

進一步將各類呼吸道病毒感染患者進行分組，對其ISG15 mRNA表達水平進行分析，結果發現IAV、RSV、MPV及PIV3感染組患者外周血ISG15 mRNA表達水平較健康對照組顯著增高，其中IAV組與RSV組表達水平增高最為顯著(見圖1C—1F)，而HRV及CoV感染患者ISG15 mRNA表達水平與健康對照組相比無顯著差異(見圖1G—1H)。

A: Respiratory virus infection group and healthy control group. B: Respiratory virus infection group and bacterial infection group. C—H: In order as follows: influenza A virus infection group (IAV), respiratory syncytial virus infection group (RSV), parainfluenza virus infection group (PIV), human metapneumovirus infection group (MPV), human rhinovirus infection group (HRV), coronavirus infection group (CoV). The different ISG15 mRNA expression levels in peripheral blood of patients with different respiratory infections compared with healthy control. *** P< 0.005

2.3 外周血ISG15 mRNA水平在呼吸道病毒感染診斷中的價值

分別對成人CAP患者中呼吸道病毒感染與細菌性感染、呼吸道感染與健康對照組的外周血ISG15 mRNA進行ROC曲線繪制。結果顯示外周血ISG15 mRNA用于區分CAP組患者呼吸道病毒感染的ROC曲線下面積可達73%(P=0.002，見圖2A)，而包括健康對照組在內的全部人群中，外周血ISG15 mRNA診斷呼吸道病毒感染的ROC曲線下面積可達到77.5%(P=0.03，見圖2B)。上述結果表明，外周血ISG15 mRNA在成人CAP患者呼吸道病毒感染與細菌性感染的鑒別診斷中具有較好的潛在應用價值。

2.4 外周血ISG15 mRNA水平在病毒性感染不同階段的動態表達特征

為了進一步研究外周血ISG15 mRNA表達在呼吸道病毒感染期間是否會隨宿主病程變化而發生改變，選取12例IAV患者、8例RSV患者、5例MPV患者及3例PIV3患者，分別收集其入院時、入院3 d及治愈出院時3個時間點的外周血樣本，對其外周血ISG15 mRNA表達水平進行動態檢測。結果顯示，呼吸道病毒感染患者在感染早期至恢復期間，外周血中ISG15 mRNA表達水平變化較為恒定，至患者出院時，其外周血ISG15 mRNA表達依舊維持在較高水平(見圖3)。這提示CAP患者發病后，其外周血ISG15 mRNA表達將在相當長的時間內維持高水平，包括患者痊愈后。

A: Influenza A virus infection. B: Respiratory syncytial virus infection. C: Human metapneumovirus infection. D: Parainfluenza virus infection.

2.5 PBMCs經體外刺激后病毒載量與ISG15 mRNA表達水平的變化趨勢

基于臨床患者在不同呼吸道病毒感染后外周血ISG15 mRNA表達水平并不一致，其中IAV、RSV、PIV3及MPV感染后ISG15 mRNA表達顯著高于HRV及CoV感染，因此分別選擇IAV及HRV為代表，在體外感染PBMCs后觀察病毒載量和ISG15 mRNA表達水平的變化情況。使用不同MOI(0.2，0.02與0.002)的IAV H1N1亞型病毒株及HRV-A型病毒株感染來自健康志愿者的PBMCs，分別在感染后12 h、24 h、48 h與72 h時檢測病毒RNA載量及ISG15 mRNA表達情況。結果表明，IAV感染PBMCs后，PBMCs中的ISG15 mRNA表達水平與IAV病毒復制水平呈正相關(見圖4A—4B)，該結果與臨床數據一致。但用HRV感染細胞時，高MOI(0.2與0.02)HRV-A毒株感染PBMCs后其ISG15 mRNA表達水平可隨HRV RNA復制水平增高而輕度增高，但在低MOI(0.002)HRV-A毒株感染細胞后，ISG15 mRNA表達水平并未出現明顯增高(圖4C—4D)。

A: Influenza A virus RNA replication. B: ISG15 mRNA expression in PBMCs after infected by IAV. C: Rhinovirus (HRV) RNA replication. D: ISG15 mRNA expression in PBMCs after infected by rhinovirus

3 討論

本研究探究了不同病原體感染情況下CAP患者外周血ISG15 mRNA的表達差異，發現在細菌性和病毒性CAP患者之間其外周血ISG15 mRNA表達差異顯著，這表明外周血ISG15 mRNA可能具有作為部分病毒性感染特異性標志物的潛在應用價值。進一步分析結果表明，部分RNA病毒(IAV、RSV、MPV及PIV3)感染與外周血ISG15 mRNA表達水平相關性更高，而細菌性感染患者及健康人群外周血中ISG15 mRNA表達基本不發生變化，提示至少在部分病毒所導致的成人CAP感染中，外周血中ISG15 mRNA表達水平可特異性增高，ROC曲線分析也證明檢測外周血ISG15 mRNA表達水平對于呼吸道病毒感染具有相當高的診斷效率。這一結果也與ISG15在既往研究中所表現出的廣譜抗病毒作用相吻合，與部分國際研究結果一致，同時也證實了病毒性感染和細菌性感染所誘導的免疫應答的特征是不同的[16]。病毒感染可導致免疫細胞分泌大量IFN-Ⅰ，進而誘導ISG基因表達，從而在患者免疫細胞中可檢測到大量ISG基因表達上調；而細菌感染主要誘導炎癥因子產生，所以外周血免疫細胞中上調的基因表達譜與病毒感染的不同。因此在CAP患者中可利用此不同類型的基因應答譜，制訂臨床上病原體鑒別診斷的新策略。這也進一步證明ISG15的作用及調控機制同病毒感染高度相關[17]。

然而，通過對臨床數據的研究，發現HRV與CoV感染患者外周血ISG15 mRNA表達水平無顯著變化。本研究中所涉及的6種病毒均為RNA病毒，其中流感病毒分屬正黏病毒科，副流感病毒、呼吸道合胞病毒及偏肺病毒均屬副黏病毒科，而鼻病毒與冠狀病毒分屬小RNA病毒科及冠狀病毒科。外周血中ISG15 mRNA在不同病毒感染之間的表達差異可能是由于各類病毒種屬間差異所導致的宿主免疫識別機制的差異所造成。雖然本研究未測定這些病毒感染后IFN以及其他細胞因子的表達水平是否存在差異，但是不能排除ISG15 mRNA的表達在不同病毒感染下的調控機制存在差異。有研究表明胞內ISG15不僅作為干擾素的應答基因參與抗病毒應答，同時也是負反饋調控干擾素表達的重要機制之一，它可以通過USP18促進I型干擾素信號通路的衰減，從而避免應答過強[8]。本研究中HRV與CoV在臨床感染患者外周血中表現出的低水平ISG15 mRNA表達可能與此兩種病毒感染對IFN通路的低刺激所導致的較弱的負反饋表現有關，但該假設需要進一步的體外實驗數據支持。值得注意的是，在體外感染PBMCs模型中，ISG15 mRNA表達水平在高MOI的HRV感染情況下同樣增高，這一結果與之前的臨床數據并不完全一致，但在低MOI刺激下，PBMCs的ISG15表達確實無明顯變化。此外，近期有研究同樣發現，在新型冠狀病毒感染患者的漿細胞中ISG15 mRNA表達水平同樣發生了顯著上調[18]。由于HRV與CoV在臨床上的致病性顯著低于其他4種病毒，因此，我們推測造成臨床HRV與CoV感染患者外周血中ISG15 mRNA表達水平無顯著變化的原因也可能與其感染后的致病情況相關：呼吸道病毒感染后所造成的宿主損傷越嚴重，免疫反應越強烈，其ISG15表達水平的上調便越顯著。

本研究還探討了外周血中ISG15 mRNA表達是否會隨患者的病程變化而動態波動。通過對不同時間點CAP住院患者外周血ISG15 mRNA的檢測發現，患者感染初期ISG15 mRNA表達升高后便會持續性地維持在較高水平，直至患者治愈出院時也未見回落。上述結果也表明宿主免疫系統一旦感知外源性病毒感染后，可以維持相當一段時間的免疫應答水平特征。其中的機制包括轉錄水平的改變，還有可能通過表觀遺傳學或是代謝調控維持相關基因的開放，從而維持應答基因的水平[7]。

近年來，大量研究闡明了ISG15在急性和潛伏性感染中的抗病毒機制，這進一步提高了人們對ISG15在病毒感染中如何發揮免疫防御功能的理解，包括描述ISG15如何改變疾病發病機制，限制組織損傷和調節IFN-I信號通路的能力[19-21]。此外，最近對ISG15缺失患者的研究以及隨后對ISG15調控IFN-I信號的總結，揭示了這一途徑的復雜性，提示需要重新評估ISG15在抗病毒過程中的作用[8, 22-23]。本研究結果表明，外周血ISG15 mRNA高水平表達與呼吸道病毒感染相關，在呼吸道病毒和細菌所誘導的CAP的鑒別診斷中具有潛在的應用價值；結合ISG15在病毒性感染患者中的表達特征，可為了解ISG15的抗病毒機制，深入解析ISG15及其他ISG家族蛋白在抗病毒免疫調節中的作用提供重要線索；也為呼吸道病毒感染的臨床診療提供了新的思路。